defosforylacja psilocybiny do psylocyny przez alkaliczną fosfatazę (pdf)
wersja pdf

zakładki

szukaj na psilosophy:  
   

Defosforylacja psilocybiny do psylocyny przez alkaliczną fosfatazę

(Dephosphorylation of psilocybin to psilocin by alkaline phosphatase)
by

A. Horita and L. J. Weber

Dept. of Pharmacology, University of Washington School of Medicine, Seattle


[ tłumaczenie: cjuchu ]

Spis Tresci:
Metody
Wyniki
Omówienie
Podsumowanie
Bibliografia

Wiele związków indolowych zyskało zainteresowanie farmakologiczne i biochemiczne z powodu ich zdolności do wytwarzania stanów psychotycznych u badanych ludzi. Sprawozdano zatem, że związki w rodzaju bufoteniny N,N-dimetylotryptaminy i harminy (1), wytwarzają zmiany zachowaniowe u człowieka i różne efekty w centralnym układzie nerwowym zwierząt eksperymentalnych. Najnowszymi dodatkami do tej klasy związków są substancje występujące w grzybie Psilocybe mexicana Heim, psilocybina i psylocyna. Chemicznie, związki te to odpowiednio 4-fosfory-N,N-dimetylotryptamina i 4-hydroksy-N,N-dimetylotryptamina. Ich struktury chemiczne są pokazane poniżej.

Według Troxlera et al. (2) psilocybina i psylocyna są pierwszymi związkami indolowymi ze źródeł naturalnych, posiadającymi zamienniki na 4-pozycyjnym pierścieniu indolowym. Psylocyna różni się od bufoteniny jedynie umiejscowieniem grupy OH, raczej na 4 niż na 5 pozycji.

Niniejszy raport dotyczy hydrolizy grupy fosforanowej psilocybiny in vitro poprzez oczyszczone przygotowanie fosfatazy z jelita cielęcego. Badania te zostały zapoczątkowane z uwagi na tę możliwość, że psilocybina może służyć jako substrat dla enzymu fosfatazy. Wydawało się to rozsądne, ponieważ inne związki aromatyczne z grupą fosforanową, są doskonałymi substratami fosfataz kwaśnych i zasadowych (3).

Metody

Wszystkie eksperymenty w tym badaniu zostały przeprowadzone przy użyciu oczyszczonej cielęcej fosfatazy jelitowej, zawierającej 15000 jednostek na miligram (Preparat oczyszczonej fosfatazy zasadowej został zamówiony z Mann Research Labs., w Nowym Jorku). Psilocybina i psylocyna zostały hojnie dostarczone przez Pana Harry'ego Althouse z Sandoz Pharmaceuticals, w San Francisco, Kalifornia.

Nieorganiczny fosforan określano według zmodyfikowanej metody Fiske i Subbarrowa (4). Psylocyna była oznaczana poprzez dostosowanie kolorymetrycznej analizy dla serotoniny, jak opisano przez Udenfriend et al. (5). Wszystkie etapy w tej procedurze były podobne do tej dla serotoniny. Końcowa reakcja między nitrozonaftolem a psylocyną w kwaśnym środowisku doprowadziła do powstania brązowawo pomarańczowego koloru w porównaniu do jasno fioletowego koloru serotoniny lub bufoteniny. Kolor przy psylocynie wykazywał maksimum absorpcji przy długości fali 540 i 430 mµ według odczytu na spektrofotometrze. Ustalenia psylocyny zostały wykonane przy 430 mµ, choć w niektórych przypadkach były one również sprawdzone przy 540 mµ. Kolory powstające ze standardowych roztworów czystej psylocyny okazały się postępować według Prawa Beera w zakresie stężenia 0,02 i 1,0 µmoli/ml.

Psilocybina reagowała również z nitrozonaftolem lecz tylko w znacznie wyższych stężeniach. Ukazała ona jasnożółty kolor, ale nie kolidowało to z odczytami psylocyny przy 430 mµ. Jednakże psilocybina, nie jest ekstraktowana do fazy butanolu, a końcowy ekstrakt kwasowy nie dał żadnej reakcji kolorowej z nitrozonaftolem. Pozwala to na selektywną ekstrakcję psylocyny przez butanol i zapobiega ingerencji jakiejkolwiek obecnej psilocybiny.

Mieszanka inkubacyjna składała się z rzeczy następujących: 0,4 ml fosfatazy jelitowej (1500 jednostek/ml) i 5,0 ml psilocybiny (2 µmole/ml) rozpuszczonych w buforze weronalowym (pH 9,2). Psilocybina była wstępnie inkubowana przez 5 minut w celu zrównoważenia do 37°C. Następnie dodano roztwór enzymu, i w różnym czasie, probówki były wyjmowane i oznaczane na psylocynę i nieorganiczny fosforan. Dla każdej probówki przeprowadzono podwójne testy.

Do dalszej identyfikacji psylocyny została zastosowana chromatografia bibułowa zstępująca mieszanin inkubacyjnych. Mieszanina butanol-kwas octowy-woda (4:1:1) działała jako rozpuszczalnik wywołujący, a plamki zostały wykryte odczynnikiem cynamoaldehydu-HCl (6).

Wyniki

Zdolność oczyszczonej alkalicznej fosfatazy jelitowej do defosforylacji psilocybiny z uwolnieniem psylocyny i nieorganicznego fosforanu jest zilustrowana graficznie na Ryc. 1. Szybka defosforylacja jest wyraźna w początkowych 15-30 minutach a później przebiega w wolniejszym tempie liniowym. Wygląda na to, że w opisanych tu warunkach, około 5 x 104 µmoli psylocyny było uwalniane przez jednostkę enzymu na godzinę. W przeciwieństwie do tego, defosforylacja disodowego mono-fenylofosforanu przez fosfatazę alkaliczną uwalnia około dwa razy tyle fenolu i nieorganicznego fosforanu. We wszystkich przypadkach uwolnienie nieorganicznego fosforanu następuje zaraz po pojawieniu się psylocyny podczas okresu inkubacyjnego.

Ryc. 1. Tempo uwalniania fosforu i psylocyny przez działanie oczyszczonej fosfatazy alkalicznej działającej na psilocybinę. Inkubacja w buforze weronalowym, pH 9,2 przy 37°C.

To że psylocyna została uwolniona z psilocybiny przez fosfatazę było oczywiste nie tylko z testów kolorymetrycznych lecz także z wartości Rf po chromatografii bibułowej. Wywołanie bibuły poprzez spryskanie odczynnikiem cynamoaldehydu-HCl ujawniło jedynie jedno identyczne pod względem położenia miejsce na standardowym pasku psylocyny. Średnia wartość Rf zarówno standardowego jak i nieznanego paska wynosiła 0,74 (średnia wartość 4 pasków). Psilocybina nie zareagowała z odczynnikiem by dać wyraźny test plamkowy.

Wpływ stężenia psilocybiny na tworzenie psylocyny jest ukazany na Ryc. 2. W tych przypadkach inkubacja była przeprowadzana przez jedną godzinę z 600 jednostkami fosfatazy alkalicznej. Jako substrat, wykorzystane zostały stężenia 1 µmola do 40 µmoli psilocybiny. Liniowa zależność pomiędzy stężeniami psilocybiny a tworzeniem psylocyny została odnotowana aż do około 4 µmoli substratu. Poza tym stężeniem, tempo tworzenia psylocyny osiągnęło plateau, wskazując na nasycenie enzymu przy nadmiarze substratu i osiągniecie reakcji zerowego rzędu.

Ponieważ wiadomo, że jon Mg++ aktywuje fosfatazę alkaliczną, jego wpływ został również przebadany z psilocybiną jako substratem. Stwierdzono, że przy stężeniach 0,35% MgSO4, uwolniona psylocyna i nieorganiczny fosforan wzrosły o około 30% ponad kontrolne.

Ryc. 2. Wpływ stężenia psilocybiny na uwalnianie psylocyny przez oczyszczoną fosfatazę alkaliczną. Inkubacje były przeprowadzane w buforze weronalowym (pH 9,2) przy 37°C przez 60 min.

Omówienie

Psilocybina jest łatwo defosforylowana przez fosfatazę jelitową do postaci nieorganicznego fosforanu i psylocyny. Nasuwa to pytanie, czy działanie psilocybiny na centralny układ nerwowy jest wytwarzane przez zdefosforylowany kongener, gdyż wiele tkanek ssaków, jak również serum, zawiera różne fosfatazy. Doświadczenia w toku wskazują, że zarówno tkanka ssacza jak i plazma są w stanie szybko defosforylować psilocybinę.

Wydaje się rozsądne, że psylocyna może wytwarzać psilocybinowy wpływ na centralny układ nerwowy gdyż ta druga byłaby wysoce zjonizowana i z mniejszym prawdopodobieństwem przenikałaby barierę krew-mózg. Oznaczenia rozpuszczalności tych 2 związków w rozpuszczalnikach organicznych i w roztworze Tyrode'a o pH 7,4 ukazały, że psylocyna jest ponad 100 razy bardziej rozpuszczalna w chloroformie niż psilocybina (wyniki niepublikowane).

Uwalnianie psylocyny z psilocybiny było łatwo określić specyficznymi metodami testowymi. Choć ściśle związane strukturą, te 2 związki reagowały dość różnie na różne odczynniki kolorystyczne. Obecnie badamy możliwość wykorzystania spektrofotofluorymetru jako sposobu na identyfikowanie małych ilości obu tych związków.

Podsumowanie

Inkubacja psilocybiny z oczyszczoną fosfatazą jelitową skutkowała uwolnieniem psylocyny i nieorganicznego fosforanu. Powstała psylocyna została określona zarówno ilościowo, dzięki specyficznej metodzie kolorymetrycznej, stosującej odczynnik nitrozonaftolu, jak i jakościowo, dzięki chromatografii bibułowej. Opisane zostały niektóre cechy działania fosfatazy na psilocybinę. Omówiona została możliwość podobnej reakcji występującej w całym zwierzęciu.

Bibliografia

  1. Carr, C. J., Int. Rec. Med., 1959, vl72, 702.
  2. Troxler, F., Seeman, F., Hofmann, A., Helv. Chim. Acta, 1959, v42, 2074.
  3. Roche, J., in The Enzymes, by J. B. Sumner and K. Myrback, 1950, vl, pt. 1, 473.
  4. Fiske, C. H., Subbarow, Y., J. Biol. Chem., 1925, v66, 375.
  5. Udenfriend, S., Weissbach, H., Brodie, B. B., Methods of Biochem. Anal., 1958, v6, 95.
  6. Block, R. J., Durrum, E. L., Zweig, G., Manual of Paper Chromatography and Paper Electrophoresis, 2nd ed., Academic Press, Inc., New York, 1958.
[ tłumaczenie: cjuchu ]



szukaj na psilosophy:  
 
Odsłon
od 01.08.2017



komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze

. .twój komentarz :

nick / ksywa :



komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze



PoradnikI ]   [ GatunkI ]   [ Honorowi psilodawcY ]   [ PsilosOpediuM ]   [ FaQ ]   [ ForuM ]   [ GalerY ]   [ TripograM ]   [ DarwiN ]   [ LinkI ]   [ EmaiL ]  

© psilosophy 2001-2018