udział receptora 5-ht2a w regulacji nauki i neurogenezy zależnych od hipokampa (pdf)
wersja pdf

zakładki

szukaj na psilosophy:  
   

Udział receptora 5-HT2A w regulacji nauki i neurogenezy zależnych od hipokampa

(Involvement of 5-HT2A Receptor in the Regulation of Hippocampal-Dependent Learning and Neurogenesis)
by

Briony J Catlow

© 2008 Briony J Catlow
Artykuł zawiera elementy badań na zwierzętach.

[ tłumaczenie: cjuchu ]

Spis Tresci:
Podziękowania
Streszczenie
Rozdział I - Wprowadzenie
 Anatomia hipokampowej neurogenezy
Regulacja neurogenezy w Zakręcie Zębatym
Neurogeneza hipokampowa a nauka
Ocenianie neurogenezy
Serotonergiczna inerwacja w zakręcie zębatym
Serotonina i neurogeneza w zakręcie zębatym
Psilocybina
Konkretne cele
 Konkretny cel 1
 Konkretny cel 2
Rozdział II - Zaangażowanie receptora 5-HT2A przy regulowaniu dojrzałej neurogenezy w hipokampie myszy
 Streszczenie
 Wprowadzenie
 Materiały i metody
  Badane obiekty
  Leki
  Procedura ogólna
  Immunofluorescencja
  Kwantyfikacja
  Projekt i analizy
 Wyniki
  Wpływ ostrego podania agonistów i antagonistów receptorów 5-HT2A invivo na przetrwanie komórek i neurogenezę w hipokampie
  Wpływ powtarzanego okresowego podawania psilocybiny na przetrwanie komórek progenitorowych i neurogenezę w hipokampie
 Omówienie
 Podziękowania
Rozdział III - Wpływ psilocybiny na śladowe warunkowanie strachowe
 Streszczenie
 Wprowadzenia
 Materiały i metody
  Obiekty badań
  Ogólna procedura
  Projekt i analizy
  Wyniki
   Nabycie
   Kontekstowe warunkowanie strachowe
   Sygnałowe warunkowanie strachowe
  Omówienie
  Podziękowania
O autorce
Bibliografia

Dysertacja przedłożona jako częściowe wypełnienie
wymagań na stopień
Doktora Filozofii
Wydziału Psychologii
Wyższej Szkoły Sztuki i Nauki
Uniwersytetu Florydy Południowej

Główny Profesor: dr filoz. Cheryl Kirstein,
dr filoz. Michael Brannick,
dr filoz. Cindy Cimino,
dr n. med. Juan Sanchez-Ramos,
dr filoz. Toru Shimizu.

Słowa kluczowe: neurogeneza, serotonina, hipokamp, warunkowanie strachowe, psilocybina.



Dla każdego kto przezwycięża przeszkody by urzeczywistnić swe marzenia...

Podziękowania

Przede wszystkim dziękuję Dr Kirstein oraz Dr Sanchez-Ramoz za pełne wsparcie podczas mych studiów podyplomowych. Dr Kirstein, walczyłaś o mnie od początku i jestem bardzo wdzięczny, ponieważ wiem, że nic z tego nie byłoby możliwe bez twego doradztwa i wsparcia. Dr Sanchez, nauczyłeś mnie myśleć o mózgu w sposób całościowy a dzięki twemu zapasjonowaniu wiedzą nauczyłem się, że neuronauka jest czymś więcej niż tylko karierą, jest sposobem na życie. Dr Paula Bickford, jesteś jedną z najbardziej wspaniałomyślnych osób jakie znam, dziękuję za wsparcie i kierownictwo i błogosławienie na tak wiele sposobów. Do Dr Brannick, Dr Cimino i Dr Shimizu, dziękuję za poświęcenie czasu by zasiąść w mojej komisji i za wnikliwe rozpatrzenie moich projektów. Chciałbym również podziękować Dr Naomi Yahneh za przewodniczenie mojej obronie.

Na płaszczyźnie osobistej, jestem bardzo wdzięczny za wsparcie rodziny. Mojej Babci, Mamy, Taty, Pam, Stevi'ego, Jodi i Joanie, wszyscy mnie wspieraliście w sposób, w jaki może wspierać tylko rodzina i mam nadzieję, że mogę zrobić dla was to samo. Do Anne, zawsze byłaś dla mnie wzorem do naśladowania, ze swym pięknem, mądrością i pozytywnością i jestem szczęśliwy, że jesteś moim życiu. Do Danielito, otworzyłeś mi oczy i trzymałeś za rękę, ahora vamos!

Streszczenie

Aberracje w mózgowej neurotransmisji serotoniny (5-HT) biorą udział w zaburzeniach psychiatrycznych, wliczając niepokój, depresję oraz deficyty uczenia się i pamięci. Wiele z tych zaburzeń leczonych jest lekami, które sprzyjają dostępności 5-HT w synapsach. Wiadomo, że selektywne inhibitory zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI) stymulują wytwarzanie nowych neuronów w hipokampie (HPC) zwiększając synaptyczne stężenie serotoniny (5-HT). Jednakże, nie jest jasne, które receptory 5-HT są zaangażowane w usprawnienia zachowaniowe i zwiększoną neurogenezę. Niniejsze badanie miało na celu zbadać wpływ agonistów 5-HT2A - psilocybiny i 251-NBmeO - oraz antagonisty 5-HT2A/C - ketanserinu - na zależną od hipokampa neurogenezę oraz naukę. Agoniści i antagoniści receptora 5-HT2A wytwarzają zmiany w neurogenezie hipokampa i w śladowym warunkowaniu strachowym. Przyszłe badania powinny zbadać czasowe efekty ostrego i przewlekłego podawania psilocybiny na zależną od hipokampa naukę i neurogenezę.

Rozdział I - Wprowadzenie

Pomysł odnośnie nowych neuronów powstających w centralnym układzie nerwowym (CUN) dorosłego jest relatywnie nowy. W latach 1960 Joseph Altman opublikował pierwszy dowód na neurogenezę, lub powstawanie nowych neuronów w dorosłym mózgu ssaka (Altman, 1962; Altman, 1963; Altman & Das, 1965). Stosując metodę trytowanej tymidyny (Sidman et al., 1959; Messier et al., 1958; Messier & Leblond, 1960) Joseph Altman był w stanie zademonstrować, że strefa okołokomorowa (SVZ - subventricular zone) komór bocznych i zakrętu zębatego (DG - dentate gyrus) hipokampa (HPC) wytwarza nowe neurony przez całe życie (Altman, 1962; Altman & Das, 1965; Altman, 1969). Przez wiele lat po odkryciu Altman'a naukowcy uznawali możliwość produkowania nowych komórek glejowych w mózgu dorosłego, lecz odrzucili koncepcję nowopowstających neuronów. Wraz z pojawieniem się nowych technologii, takich jak bromodeoksyurydynowa (BrdU) metoda datowania komórek i podwójne znakowanie przy pomocy immunofluorescencji, neurogeneza została zidentyfikowana u wielu gatunków dorosłych ssaków, wliczając myszy (Kempermann et al., 1998), szczury (Kaplan & Hinds, 1977), chomiki (Huang et al., 1998), wiewióreczniki (Gould et al., 1997), naczelne nieczłowiecze (Gould et al., 1999b; Bernier et al., 2002) i ludzi (Eriksson et al., 1998). Odkrycie nowych neuronów w ludzkim HPC przez Petera Eriksson'a zmieniło postrzeganie neurogenezy w społeczności naukowej, więc obecnie, fakt iż nowe neurony są wytwarzane w dorosłym mózgu jest mocno ugruntowany.

Anatomia hipokampowej neurogenezy

HPC jest podzielony na cztery obszary: DG (zwany także obszar zębaty [area dentate] lub powięź zębata [fascia dentata]), Róg Amona [Cornu Ammonis] (CA, podzielony dalej na CA1, CA2, CA3 i CA4), przedpodpora i podpora [przedsubikulum-presubiculum, subikulum-subiculum]. Ten anatomiczny opis HPC został potwierdzony przez zarówno ekspresję genową jak i połączenia włókniste. DG oraz obszary CA tworzą obwód trójsynaptyczny wewnątrz HPC (zobacz Rycina 1,1). Neurony w korze śródwęchowej (EC - entorhinal cortex) projektują do dendrytów komórek ziarnistych w DG tworząc szlak przeszywający (perforant pathway). Aksony komórek ziarnistych rozciągają się (Ramon, 1952) do neuronów piramidowych w obszarze CA3, tworząc szlak włókien mszystych (Ribak et al., 1985). Piramidowe neurony CA3 projektują do regionu CA1 przeciwległego [contralateral] (poprzez skojarzeniowy szlak spoidłowy) i do przyległego [ipsilateral], tworząc równoległy szlak Schaffer'a. Aksony neuronów piramidowych w CA1 rozciągają się do podpory a z podpory z powrotem do EC (po szczegółowy opis obwodów hipokampowych patrz (Witter, 1993)).

Ryc. 1,1 - Anatomia hipokampa. HPC tworzy trójsynaptyczny szlak z wejściami z Kory Śródwęchowej (EC), które projektują do Zakrętu Zębatego (DG) oraz neuronów piramidowych CA3 poprzez szlak przeszywający. Komórki ziarniste w DG projektują do CA3 poprzez szlak włókien mszystych. Neurony piramidowe w CA3 projektują zarówno do przeciwległego (skojarzeniowy szlak spoidłowy) oraz do przyległego regionu CA1 poprzez Równoległy Szlak Schaffer'a. Neurony piramidowe CA1 wysyłają swe aksony do podpory (Sb), która z kolei wyprojektowuje je z powrotem z HPC do EC.

W normalnych warunkach fizjologicznych, neurogeneza występująca w HPC ma miejsce jedynie w DG i skutkuje tworzeniem nowych komórek ziarnistych. Wewnątrz DG, komórki progenitorowe znajdują się w wąskim paśmie pomiędzy DG a wnęką (zwaną także CA4 lub warstwą pleksiformową) zwanym strefą podziarnistą (SGZ - subgranular zone), która ma grubość średnio 2-3 komórek (20-25 µm) (zobacz Rycina 1,2). Nerwowe komórki progenitorowe (1) rozdzielają i formują klastry komórek proliferacyjnych (2). Komórki proliferacyjne wychodzą z cyklu komórkowego i zaczynają się różnicować w niedojrzałe neurony (3). Niedojrzała komórka ziarnista wytwarza prądy sodowe, wypuszcza dendryty i akson by utworzyć połączenia z innymi komórkami i uformować synapsy by stać się dojrzałym neuronem (4). SGZ zawiera wiele typów komórek, wliczając astrocyty (Seri et al., 2001; Filippov et al., 2003; Fukuda et al., 2003), kilka typów glejowych i neuronowych komórek progenitorowych (Filippov et al., 2003; Fukuda et al., 2003; Kronenberg et al., 2003; Seri et al., 2004) oraz neurony we wszystkich stadiach różnicowania i dojrzałości (Brandt et al., 2003; Ambrogini et al., 2004).

Ryc. 1,2 - Neurogeneza w Zakręcie Zębatym Hipokampa. Nerwowe komórki macierzyste znajdują się w SGZ Zakrętu Zębatego, komórki te następnie się dzielą, różnicują i dojrzewają do swego fenotypowego przeznaczenia. Neuralne komórki progenitorowe (1) dzielą się i tworzą skupiska komórek proliferacyjnych (2). Komórki proliferacyjne opuszczają cykl komórkowy i zaczynają się różnicować w niedojrzałe neurony (3). Niedojrzała komórka ziarnista wytwarza prądy sodowe, dendryty oraz wypuszcza akson by nawiązać połączenia z innymi komórkami i by utworzyć synapsy aby stać się dojrzałą komórką ziarnistą (4).

Regulacja neurogenezy w Zakręcie Zębatym

Na proliferację i przetrwanie progenitorów neuronowych w dorosłym HPC można wpłynąć w sposób pozytywny i negatywny dzięki różnym bodźcom. Z regulacją neurogenezy powiązane zostały czynniki tak różnorodne jak stres, zapachy, neurotrofiny, leki psychoaktywne takie jak antydepresanty, opioidy oraz alkohol, terapia elektrowstrząsami, ataki, niedokrwienie, napromienianie mózgu, aktywność fizyczna, uczenie się, hormony oraz wiek, pośród wielu innych (Kempermann et al., 1998; Van et al., 1999b; Malberg et al., 2000; Malberg & Duman, 2003; Tanapat et al., 2001). Niektóre z tych czynników zostały obszernie przebadane a ich rola w regulacji neurogenezy jest dobrze określona. Na przykład, urozmaicenie środowiskowe oraz aktywność fizyczna są bardzo pozytywnymi regulatorami neurogenezy (Van et al., 1999b; Kempermann et al., 1997), podczas gdy stres i wiek (Cameron et al., 1993; Kempermann et al., 1998) zdają się być negatywnymi regulatorami neurogenezy.

Pierwszym raportem o jakimkolwiek czynniku zwiększającym neurogenezę w mózgu ssaczym, było urozmaicone środowisko. W otoczeniu eksperymentalnym, urozmaicone środowisko gryzonia składa się zazwyczaj z dużej klatki, dużej liczby zwierząt, zabawek i systemu tunelowego. W celu podtrzymania aspektu urozmaiceniowego, wprowadzane zostają nowe zabawki, a system tunelowy jest regularnie przegrupowywany. Myszy (Kempermann et al., 1997) i szczury (Nilsson et al., 1999) żyjące w środowisku urozmaiconym ukazały silne podregulowanie proliferacji komórkowej i neurogenezy w Zakręcie Zębatym HPC. Proneurogenny wpływ urozmaicenia środowiskowego może zostać jeszcze bardziej zwiększony w zależności od wieku zwierzęcia gdy nastąpi wyeksponowanie. Gdy opóźnione (ang.-late) młodociane/młode dorosłe zwierzęta żyją w środowisku urozmaiconym zwiększa to zdolność środowiskowego urozmaicenia do podregulowania komórkowej proliferacji i neurogenezy w DG. W rzeczywistości, gdy w późniejszym życiu została przebadana morfologia HPC, zaobserwowano dużą ilość pełnych komórek ziarnistych (Kempermann et al., 1997). U starszych zwierząt (zazwyczaj 18 miesięcy lub więcej u gryzoni) zaobserwowano niższe poziomy neurogenezy, jednak życie w środowisku urozmaiconym przeciwdziała efektom starzenia (Kempermann et al., 1998). Kempermann i współpracownicy zademonstrowali, że urozmaicenie środowiskowe podczas starzenia zwiększa komórkową proliferację i neurogenezę w DG (Kempermann et al., 1998). Ponadto, jeśli zwierzęta żyją w środowisku urozmaiconym w wieku średnim, podstawowe poziomy neurogenezy wzrastają aż pięciokrotnie w wieku podeszłym.

Gdy rozpoczęło się eksperymentowanie ze środowiskowym urozmaicaniem, jako część doświadczania środowiskowego urozmaicenia włączane były nowe pokarmy. Gdy myszy żyjącej albo w urozmaiconym albo w kontrolowanym środowisku podawany był podobny pokarm, wpływ urozmaicenia środowiskowego wciąż był obecny. Jednakże stwierdzono, że szczególnie jeden rodzaj diety ma pozytywny wpływ na neurogenezę, ograniczenie kalorii (Lee et al., 2000). Eksperymentalna manipulacja ograniczaniem kalorii polega zazwyczaj na zmniejszeniu o jedną trzecią ilości pokarmu jakie zwierzę może zjeść. Ograniczenie kalorii jest jedynym czynnikiem, który, jak eksperymentalnie wykazano, zwiększa długość życia zwierząt i uważa się, że ograniczenie kalorii działa faktycznie jako łagodny stresor. Warto zauważyć, że choć urozmaicenie środowiskowe jest silnym pozytywnym regulatorem neurogenezy hipokampa u dorosłego, nie wpływa na neurogenezę dorosłego w układzie powonienia (Brown et al., 2003).

Wyeksponowanie na urozmaicone środowisko zwiększa neurogenezę w DG dorosłych gryzoni, jednakże środowiskowe urozmaicenie obejmuje zazwyczaj kółko do biegania jak i zwiększoną aktywność fizyczną. Wiadomo, że aktywność fizyczna podregulowuje proliferację komórkową i neurogenezę w DG. Gryzonie w pełni wykorzystują okazję do ćwiczenia na kółku do biegania podczas aktywnej fazy swego dnia. Sprawozdano, że myszy przebiegają w nocy na kółku do biegania między 3 a 8 km (Van et al., 1999a; Van et al., 1999b). Wykazano, że dobrowolna aktywność fizyczna zwiększa ilość komórek progenitorowych i nowych neuronów w DG hipokampa (Van et al., 1999a; Van et al., 1999b). Wpływ biegania na neurogenezę jest dojmujący, tak więc bieganie musi trwać by wpływało na neurogenezę, a gdy zwierzę nie korzysta już z kółka do biegania wpływ na neurogenezę maleje. Podregulowanie neurogenezy dorosłego aktywnością fizyczną zwiększa również nasilenie długoterminowe (LTP - long term potentiation) w DG i wzmacnia wydajność w labiryncie wodnym Morrisa (MWM - Morris water maze) (Van et al., 1999a). MWM jest zadaniem zachowaniowym, które ocenia pamięć i uczenie się, lecz jako część zadania, zwierzęta umieszczane są w basenie wodnym i zmuszane do pływania. Niektórzy twierdzili, że pływanie, będące aktywnością fizyczną, także może wpływać na wynik zadania. Kwestią tą zajął się Ehninger et al., który stwierdził, że mimowolna aktywność fizyczna (pływanie w promienistym ramiennym labiryncie wodnym [RAWM - radial arm water maze]) nie wpływa na neurogenezę hipokampa (Ehninger & Kempermann, 2003).

Mechanizmy leżące u podstaw wzrostu neurogenezy przy aktywności fizycznej są jednak nieznane, silnie zaangażowane były czynniki wzrostu, takie jak insulinowy czynnik wzrostu-1 (IGF-1 - insulin growth factor), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF - vascular endothelial growth factor), oraz neurotropowy czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF - brain derived neurotrophic factor). Poziomy IGF-1 są zwiększone w HPC zwierząt biegających oraz przy wywołanych bieganiem wzrostach proliferacji komórkowej i neurogenezy (Carro et al., 2001; Carro et al., 2000; Trejo et al., 2001). Ten wzrost neurogenezy jest blokowany przez oczyszczające wychwytywanie IGF-1 nieobecne u osobników ze zmutowanym IGF-1 (Carro et al., 2000). Dla wpływu biegania na neurogenezę dorosłego hipokampa konieczny jest VEGF. Blokowanie obwodowe VEGF likwidowało wzbudzenie neurogenezy wywoływanej bieganiem, jednakże nie dawało wykrywalnych wpływów na bazową neurogenezę u zwierząt niebiegających (Fabel et al., 2003). Analiza ilościowa reakcji łańcuchowej polimerazy ujawniła, że poziomy BDNF mRNA są istotnie zwiększone w DG u biegających szczurów (Farmer et al., 2004). BDNF jest kluczowym czynnikiem zaangażowanym w modulowanie neuroplastyczności obejmującej LTP i neurogenezę. Wlewy BDNF do komór bocznych wywoływały neurogenezę pochodzącą z SVZ (Pencea et al., 2001) a myszy ze znokautowanym (KO) BDNF miały zmniejszone poziomy neurogenezy w DG (Lee et al., 2002). Tak jak urozmaicenie środowiskowe, aktywność fizyczna podregulowuje neurogenezę dorosłego hipokampa, jednakże nie wpływa na dorosłą neurogenezę w układzie powonienia (Brown et al., 2003).

Stres dotkliwie osłabia neurogenezę hipokampa. Jedno z pierwszych badań łączących stres z neurogenezą hipokampa zostało przeprowadzone przez Gould i współpracowników (1992). Stwierdzili oni, że stres zwiększa ilość komórek umierających w HPC lecz, że całkowita ilość komórek ziarnistych w zakręcie nie była różna u niezestresowanych kontrolnych i wywnioskowali, że by podtrzymać komórkową równowagę musi zachodzić neurogeneza (Gould et al., 1992). Postulowali, że hormon stresu, kortyzol u ludzi i kortykosteron u gryzoni, pośredniczy we wpływie stresu na neurogenezę i doszli do odkrycia, że adrenalektomia (usunięcia nadnercza, co za tym idzie, źródła endogennego kortykosteronu) doprowadzała do podregulowania neurogenezy a egzogenny kortykosteron obniżał proliferację komórkową i neurogenezę w DG (Cameron et al., 1993). Od czasu tych wczesnych eksperymentów, wykazano, przy zastosowaniu wielu różnych paradygmatów, że dotkliwy stres obniża proliferację komórkową i kolejne etapy rozwoju neuronalnego. Stres prenatalny powoduje deficyty nauki i ma ujemny wpływ na neurogenezę, które trwają w życiu dorosłym (Lemaire et al., 2000). Wpływ stresu psychospołecznego na neurogenezę został zademonstrowany przy użyciu modelu rezydent-intruz u terytorialnych wiewióreczników (Gould et al., 1997). Wiewióreczniki są niezwykle terytorialne i strzegą swego otoczenia tak, że wprowadzenie intruza do klatki rezydenta jest niezwykle stresujące. Terytorialne wiewióreczniki rywalizują o dominację i wkrótce po wprowadzeniu intruza wykształca się relacja dominujący-podporządkowany, skutkując podwyższeniem kortyzolu i spadkiem neurogenezy u podporządkowanego wiewiórecznika (Gould et al., 1997). Zapach drapieżnika wyzwalał reakcję stresową u zdobyczy i miał ujemne skutki na proliferację komórkową. W modelach gryzoni, zapach lisa okazał się zmniejszać proliferację komórkową i neurogenezę w DG (Tanapat et al., 2001). Zarówno ostry jak i przewlekły stres ograniczający, okazały się wpływać na współczynnik neurogenezy dorosłego hipokampa. Pham i współpracownicy wykazali, że 6 tygodni ograniczającego stresu, codziennie, stłumiło proliferację i osłabiło przetrwanie nowopowstałych komórek, skutkując 47% zmniejszeniem neurogenezy komórek ziarnistych (Pham et al., 2003). Neurogeneza jest nie tylko afektowana bodźcem środowiskowym, brak bodźca, taki jak izolacja społeczna, ujemnie regulowało neurogenezę. Młode szczury hodowane w izolacji społecznej przez 4-8 tygodni przejawiły zmniejszoną wydajność w MWM i zmniejszoną neurogenezę hipokampa (Lu et al., 2003). W wyuczonym modelu bezradności depresji, zwierzęta wystawiane są na nieuchronny wstrząs nóg przy użyciu testów unikania. Wystawienie na nieuchronny wstrząs zmniejszało proliferację komórkową w HPC, poszerzając poprzednie badania wykazujące obniżenie neurogenezy przez wystawienie na działanie ostrych stresorów (Malberg & Duman, 2003).

Kluczowym mechanizmem leżącym u podstaw negatywnego wpływu, jaki stres wywiera na neuroplastyczność, zdaje się być wydzielanie hormonu stresu (glukokortykoidu) (Cameron et al., 1993). Ostry, dotkliwy i czasem traumatyczny stres prowadzi do przewlekle wysokich poziomów glukokortykoidów i zmienia funkcjonowanie osi hipotalamiczno-adrenalinowo-przysadkowej (HPA - hypothalamic-adrenal-pituitary), skutkując rozregulowaniem wydzielania glukokortykoidu i ekspresji receptorowej. Depresja jest przykładem stanu klinicznego związanego z zakłóconą regulacją osi HPA, rozstrajając dobowy rytm wydzielania hormonu, co skutkuje przewlekle podwyższonymi poziomami glukokortykoidu i zmniejszeniem neurogenezy (Jacobs et al., 2000).

Starzenie jest kolejnym czynnikiem, o którym wiadomo, że ma silny negatywny wpływ na neurogenezę. Wiadomo o tym od czasu odkrycia neurogenezy dorosłych przez Altman'a i Das'a w 1965. W pierwotnym badaniu, progresywny spadek poziomów neurogenezy został zaobserwowany po okresie dojrzewania i trwał do starości (Altman & Das, 1965), a odkrycie to zostało od tego czasu powtórzone zarówno u szczurów (Seki & Arai, 1995; Kuhn et al., 1996; Cameron & McKay, 1999; Bizon & Gallagher, 2003), myszy (Kempermann et al., 1998) oraz u ludzi (Eriksson et al., 1998). Najwyższe poziomy neurogenezy u dorosłych występowały we wczesnym wieku dojrzałym i stopniowo malały w ciągu życia. W starszym wieku (zazwyczaj 18 miesięcy lub więcej u gryzoni) bazowe poziomy neurogenezy są niezwykle niskie, jednakże istnieją sposoby na zwiększenie neurogenezy w podstarzałym hipokampie. Urozmaicenie środowiskowe podczas starzenia zwiększa proliferację komórkową i neurogenezę w DG, jednakże wpływ urozmaiconego środowiska jest silniejszy u młodych zwierząt (Kempermann et al., 1998). Zwierzęta, które żyły w urozmaiconym środowisku zaczynając od wieku średniego, miały pięciokrotne wzrosty bazowych poziomów neurogenezy w wieku podeszłym (Kempermann et al., 1998). Poziomy kortyzolu (lub kortykosteronu u gryzoni) są podwyższone w procesie starzenia, co prawdopodobnie redukuje bazową proliferację i neurogenezę. Adrenalektomia u podstarzałych zwierząt przywracała neurogenezę u dorosłych w DG do poziomu porównywalnego z poziomem o wiele młodszego wieku, wykazując, że kortykosteron jest przynajmniej częściowo odpowiedzialny za spadek neurogenezy obserwowanej w procesie starzenia (Cameron & McKay, 1999). Poziomy IGF-1 są zwiększone w HPC zwierząt biegających, a bieganie indukowało wzrosty w proliferacji komórkowej i neurogenezie (Carro et al., 2001; Carro et al., 2000; Trejo et al., 2001). Podobnie, podanie podstarzałym zwierzętom egzogennego IGF-1 by przywrócić poziomy endogennego IGF-1 do poziomów wieku młodszego i by wywołać neurogenezę większą niż u kontrolnych, zneutralizowało ujemny wpływ starzenia na neurogenezę (Lichtenwalner et al., 2001).

BDNF uważa się za kluczowy czynnik wydzielniczy modulujący plastyczność mózgu. Aktywność fizyczna, która znana jest z dodatniego regulowania neurogenezy i indukowania LTP, wywołuje hipokampową ekspresję BDNF mRNA. Uważa się, że BDNF może modulować wpływ, jaki aktywność fizyczna wywiera na LTP i neurogenezę (Farmer et al., 2004). Wlewy BDNF do komór bocznych wywoływały neurogenezę zapoczątkowywaną w SVZ (Pencea et al., 2001) a KO BDNF u myszy zmniejszyło poziomy neurogenezy hipokampowej (Lee et al., 2002). W warunkach patologicznych, takich jak depresja, BDNF blokuje neurogenezę (co jest przeciwieństwem u zdrowych zwierząt) i obecnie rozumie się, że jedną z krytycznych funkcji BDNF jest utrzymywanie neurogenezy w zakresie fizjologicznym. Funkcja BDNF została powiązana z neurogenezową hipotezą depresji, ideą, że antydepresanty zwiększają neurogenezę, a BDNF jest kluczowym regulatorem tego mechanizmu (Jacobs et al., 2000; D'Sa & Duman, 2002). Antydepresanty (wliczając selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRIs)) wywołują fosforylację CREB, po której CREB wiąże się z promotorem BDNF i indukuje transkrypcję BDNF. Agoniści receptora 5-HT2A, tacy jak 2,5-dimetoksy-4-jodoamfetamina (DOI), zwiększają ekspresję BDNF mRNA w HPC (Vaidya et al., 1997). BDNF bierze udział w indukowaniu neuronalnego różnicowania umożliwionego przez indukowanie syntazy neuronalnego tlenku azotu (nNOS - neuronal nitric oxide synthase), który jak wykazano, zatrzymuje proliferację i sprzyja różnicowaniu. BDNF jest invitro czynnikiem różnicującym, który może regulować w dół proliferację komórek prekursorowych (Cheng et al., 2003).

Neurogeneza hipokampowa a nauka

Pamięć wymaga kodowania, przechowywania i przypominania informacji. HPC odgrywa kluczową rolę przy uczeniu się i pamięci poprzez przekształcanie wspomnień krótkoterminowych we wspomnienia długoterminowe i jest decydujący przy kodowaniu, wzmacnianiu i odzyskiwaniu wspomnień epizodycznych (Squire et al., 1992; Squire, 1992). Przeprowadzono kilka badań związku między uczeniem się a neurogenezą hipokampową. Pośredniczone hipokampowo uczenie się i pamięć wykazały związek z powstawaniem nowych neuronów w dorosłym DG (Van et al., 2002; Nilsson et al., 1999).

Postulowano, że tylko zadania uczenia się, które są zależne od hipokampa, wpływają na progenitorową proliferację komórkową i neurogenezę w DG (Gould et al., 1999a). Pomysł ten od czasu jego zademonstrowania wykorzystuje zadanie uczenia się, które jest łatwo manipulowalne by było albo zależne od hipokampa albo niezależne. Uczenie zależne od hipokampa może być oceniane przy użyciu śladowego warunkowania mrugania oczami. Przy warunkowaniu śladowym, bodziec warunkowy (CS - conditioned stimulus), dźwięk, rozbrzmiewa przez 5 sekund, następnie po przerwie 100-1000 ms, aktywowany jest bodziec bezwarunkowy (US - unconditioned stimulus) w postaci podmuchu powietrza lub wstrząsu powieki. W ten sposób CS i US nie zachodzą na siebie. Naukę niezależną od hipokampa można ocenić przy zastosowaniu opóźnionego warunkowania mrugania oczami. Przy opóźnionym warunkowaniu mrugania oczami, dźwięk (CS) rozbrzmiewa przez 5 sekund a w ostatnich 20 ms brzmienia dźwięku uaktywniany jest podmuch powietrza (US). W ten sposób CS i US nachodzą na siebie. Shors i współpracownicy stosowali zarówno śladowe jak i opóźnione warunkowanie mrugania by wykazać, że śladowe warunkowanie mrugania, zadanie zależne od hipokampa, zależy od neurogenezy, podczas gdy opóźnione warunkowanie mrugania nie zależy. Myszy zostały potraktowane octanem metyloazoksymetanolu (MAM), środkiem antymitotycznym, który niweluje populację komórek progenitorowych w DG i podano im BrdU dla oznaczenia daty narodzin komórek, a następnie przeprowadzano albo śladowe albo opóźnione warunkowanie mrugania. Zarówno przy śladowym jak i opóźnionym warunkowaniu mrugania, myszy potraktowane roztworem soli fizjologicznej, dobrze wykonały zadanie i miały podobne ilości BrdU dodatnich komórek w DG. Jest to sprzeczne z myszami potraktowanych MAM, które wytworzyły odmienne wyniki dla śladowego oraz opóźnionego warunkowania mrugania. Przy śladowym warunkowaniu mrugania, MAM poważnie osłabił uczenie się i zatarł wprowadzenie BrdU do DG, natomiast nie zaobserwowano żadnego osłabienia nauki po opóźnionym warunkowaniu mrugania, pomimo że myszy zostały potraktowane MAM, zacierającym tym samym pulę progenitorową i skutkującym dramatycznym zmniejszeniem BrdU dodatnich komórek w DG (Shors et al., 2001). Wyniki te wyraźnie wskazują, że nowo wytworzone neurony w dorosłym DG znajdują się pod wpływem powstawania pamięci zależnej od hipokampa.

Wykazano, że tylko niektóre rodzaje zadań zależnych od hipokampa zaangażowane są w neurogenezę hipokampa (Shors et al., 2002). Zostało to wykazane przy zastosowaniu dwóch różnych paradygmatów uczenia się, które wiadomo, że wymagają HPC, zadanie nawigacji przestrzennej oraz śladowe warunkowanie strachowe. Podobnie jak w badaniu wspomnianym wcześniej, myszy zostały potraktowane MAM oraz BrdU, następnie oceniono wydajność w którymś zadaniu behawioralnym. Zadanie nawigacji przestrzennej jest wykonywane w MWM i wymaga by mysz wykorzystywała przestrzenne wskazówki z otoczenia (jak czarny kwadrat na ścianie) do nawigowania i do odnalezienia platformy. W miarę prób myszy uczyły się gdzie umieszczona była platforma i traciły mniej czasu na jej odnalezienie. MAM nie udało się doprowadzić do osłabienia latencji ucieczki lecz istotnie zredukował komórki BrdU+ w SGZ, wykazując, że hipokampowa proliferacja komórek progenitorowych nie jest niezbędna dla tego zależnego od hipokampa zadania (Shors et al., 2002). W oddzielnej grupie myszy przeprowadzono śladowe warunkowanie strachowe, które tak jak śladowe warunkowanie mrugania wymaga luki czasowej między prezentacją CS i US. W śladowym warunkowaniu strachowym MAM poważnie osłabił naukę i istotnie zmniejszył inkorporację BrdU w DG, dostarczając tym samym więcej dowodów na udział śladowego warunkowania w neurogenezie hipokampowej (Shors et al., 2002). Powyższe eksperymenty wyraźnie wykazują, że pewne formy uczenia się są zależne od HPC lecz nie wszystkie zadania nauki zależne od hipokampa wymagają neurogenezy.

HPC jest zaangażowany w tworzenie i wyrażanie pamięci w zadaniu biernego unikania u szczurów (Cahill & McGaugh, 1998). Logika leżąca u podstaw zadania biernego unikania (PA - passive avoidance) jest taka, że zwierzęta kojarzą konkretne otoczenie z nieprzyjemnym wstrząsem stopy i uczą się, unikając otoczenia, że mogą uniknąć nieprzyjemnego wstrząsu stopy. W związku z tym, uważa się, że wzrost latencji reakcji odzwierciedla siłę wspomnienia o nieprzyjemnym wydarzeniu (Sahgal & Mason, 1985). Dokładniej, wieloziołowa formuła BR003 zwiększyła latencję reakcji, a zatem wspomnienie o wstrząsie stopy, zwiększając jednocześnie ilość dodatnich komórek BrdU w DG (Oh et al., 2006). Zadanie PA jest względnie szybkie i proste lecz dostarcza ograniczoną informacji odnośnie wspomnienia, że latencje zwiększają następujący wstrząs. Zmodyfikowana wersja PA, paradygmat unikania aktywnego, mierzy nabycie (nauczenie), retencję (pamięć) oraz zanik warunkowanej reakcji.

Aktywne unikanie jest asocjacyjnym zadaniem unikania, motywowanym strachem. W zadaniu tym mysz ma się nauczyć przewidywać występowanie nieprzyjemnego wydarzenia (wstrząs) na podstawie prezentacji specyficznego bodźca (dźwięk), w celu uniknięcia nieprzyjemnego wydarzenia, poprzez przejście do innej przegrody. Zarejestrowane pomiary obejmują ilość uniknięć (mysz przechodząca do innej przegrody podczas sygnału ostrzegającego), ilość braków reakcji (mysz nie przechodząca do innej przegrody podczas próby), latencję reakcji (latencję uniknięcia lub ucieczki), ilość reakcji międzypróbowych (tj. przekroczenie bariery w ciągu okresu międzypróbowego), i służą jako wskaźnik uczenia się, pozwalający na ocenę pamięci.

Wiele badań wsparło rolę HPC w nauce z aktywnym unikaniem. LTP poprzez elektryczną stymulację szlaku przeszywającego jest negatywnie skorelowane z nauką w krótkobieżnym boksie do zadania unikania (shuttle box avoidance task), sugerując, że trening aktywnego unikania obniżył częstotliwość progową do wywoływania LTP w DG (Ramirez & Carrer, 1989). Nauka aktywnym unikaniem zwiększyła długość postsynaptycznego zagęszczenia w molekularnej warstwie komórkowej DG (Van et al., 1992) i zwiększyła immunoreaktywność dla receptorów muskarynowych w warstwie komórek ziarnistych (Van der Zee & Luiten, 1999). Dwudrożne aktywne unikanie zwiększyło także syntezę BDNF (Ulloor & Datta, 2005) oraz wiązanie elementu reakcji cAMP (CREB - cAMP response element binding) w grzbietowym HPC (Saha & Datta, 2005). Szczury, które uczono zadania aktywnego unikania szoku (respondenci) miały podobne poziomy komórek dodatnich BrdU i dodatnich Ki67 w DG jako nierespondenci, sugerując, że ASA nie wpływa na hipokampową proliferacją komórek progenitorowych (Van der et al., 2005).

Badanie unikania aktywnego jest powszechnie stosowane po wystawieniu na dotkliwy nieuchronny wstrząs stopy w naukowym bezsilnym modelu depresji. Wystawianie na nieuchronny wstrząs stopy zmniejszyło proliferację komórek progenitorowych w DG a efekt ten jest odwracany przez długotrwałe leczenie fluoksetyną (Malberg & Duman, 2003). Jednym z targetów terapii antydepresantem jest BDNF, ponieważ antydepresanty nie tylko zwiększają ekspresję CREB w szczurzym HPC (Nibuya et al., 1996) lecz także zwiększają ekspresję BDNF (Nibuya et al., 1995). BDNF wytwarzał efekt podobny do antydepresyjnego w wyuczonym bezsilnym modelu depresji (Shirayama et al., 2002).

Ocenianie neurogenezy

Ogólnoustrojowe wstrzyknięcie radioaktywnie oznakowanej trytem tymidyny, było pierwszą metodą opracowaną do oznaczania podziału komórek (Messier et al., 1958). Będąc w krwiobiegu, trytowana tymidyna rywalizuje z tymidyną endogenną we wszystkich komórkach w fazie S podziału komórki i jest na trwałe włączana w DNA. Oznakowana tymidyna posiada krótki okres półtrwania in vivo i znakuje wszystkie komórki w procesie jej podziału gdy wstrzyknięty zostanie znacznik. Później preparowane są przekroje tkankowe i pokrywane emulsją fotograficzną. Promieniowanie z oznakowanych cząstek tymidyny zaczernia emulsję fotograficzną, tym samym uwidaczniając typowe ziarna autoradiografii tymidynowej. Wykorzystując metodę trytowanej tymidyny (Sidman et al., 1959; Messier et al., 1958; Messier & Leblond, 1960) Joseph Altman był w stanie wykazać, że SVZ i DG w HPC wytwarzają nowe neurony w ciągu całego życia (Altman, 1962; Altman & Das, 1965; Altman, 1969).

BrdU jest sztuczną bazą, która rywalizuje z endogenną tymidyną i zostaje trwale wcielona w DNA podczas fazy S cyklu komórkowego. BrdU jest na ogół podawana wstrzyknięciem zazwyczaj 50-250 mg/kg w jednym rzucie lub przez kilka dni w zależności od paradygmatu eksperymentalnego (Corotto et al., 1993). BrdU jest użyteczna, ponieważ jest to znacznik trwały, tak więc wszystkie komórki, które ekspresjonują BrdU mogą być bezpośrednio związane z czasem, w którym została podana BrdU, dostarczając tym samym daty narodzin komórki. Należy zauważyć, że BrdU może zostać wcielona w komórki, które są one na skraju śmierci, gdy mechanizmy związane ze śmiercią komórki uruchamiają naprawianie DNA, w związku z tym aby określić, czy komórka jest faktycznie proliferacyjna należy uwzględnić właściwe kontrole, takie jak immunohistochemiczne plamy dla apoptozy (kaspaza-3 lub TUNEL) oraz znaczniki proliferacyjne (Ki67).

Współczynnik proliferacji można odróżnić od współczynnika przeżycia poprzez manipulację czasem pomiędzy wstrzyknięciem BrdU a poświęceniem, więc namnożone komórki mogą zostać określone przez poświęcenie zwierząt 24 godziny po wstrzyknięciu BrdU. W ten sposób BrdU miała czas by się przyłączyć do komórki lecz komórka nie miała czasu by się zróżnicować w neuron, proces, który zajmuje minimum 72 godziny. Przeżycie można określić pobraniem mózgów zwierząt, kilka dni, tygodni a nawet miesięcy po wstrzyknięciu BrdU. Fenotypowy los komórki jest określany w warunku przeżycia poprzez podwójne znakowanie BrdU z kolejnym znacznikiem. Tabela 1 przedstawia podsumowanie powszechnych znaczników stosowanych do określania fenotypu progenitorów neuronowych.

Tabela 1. Przeciwciała stosowane do oceniania fenotypowego losu progenitorów.
ZnacznikZnaczenieOdnośnik
Ki67Proliferacja; ostatnie fazy G1, S, G2 oraz M.
jądrowy
(Scholzen & Gerdes, 2000)
Dublokortyna (DCX) (ang. Doublecortin)Niedojrzały neuron; białko związane z mikrotubulą wzbogacone w migracyjne komórki nerwowe. Wczesny znacznik neuronalny z określonym rodowodem i ograniczonym samoodnawianiem.
dendrytyczny
(Meyer et al., 2002)
III β-tubulina (Tuj1)Niedojrzały neuron; białko tubulina.
soma i procesy
(Uittenbogaard & Chiaramello, 2002)
Kalretynina (CRT - Calretinin)Niedojrzałe neurony; białko wiążące wapń przejściowo.(Brandt et al., 2003)
Jądra neuronów (NeuN)Dojrzałe neurony; głównie w jądrach lecz może być wykrywany w cytoplazmie.
jądro
(Mullen et al., 1992)
Kwaśne włókienkowe białko glejowe (GFAP - Glial fibrillary acidic protein)Pośrednie białko włókien wyrażone w astrocytach.(Fuchs & Weber, 1994)

Jeśli komórka ekspresjonuje Ki67 jest wczesnym progenitorem gdyż Ki67 jest białkiem ekspresjonowanym fazami G1, S, G2 i M cyklu komórkowego (Scholzen & Gerdes, 2000). Komórki, które ekspresjonują dublokortynę (DCX), β-tubulinę III (IIIβ-tubulina, Tuj1), lub kalretyninę (CRT) są niedojrzałymi neuronami. DCX jest białkiem związanym z mikrotubulą przejściowo ekspresjonowaną w niedojrzałych neuronach (Meyer et al., 2002), Tuj1 znakuje tubulinę w mikrotubulach (Uittenbogaard & Chiaramello, 2002) a CRT jest białkiem wiążącym wapń, przejściowo ekspresjonowanym w niedojrzałych neuronach i jest ekspresjonowane w rozwijającym się neuronie na etapie, na którym ekspresja DCX zanika (Brandt et al., 2003). Najlepszym i najpowszechniej stosowanym znacznikiem do identyfikowania dojrzałych neuronów są jądra neuronów (NeuN) (Mullen et al., 1992). Ekspresja NeuN jest ograniczona do neuronów pomitotycznych i jest przeważnie umiejscowiona w jądrach neuronów, choć czasem może być obserwowana w neurytach. W celu przekonującego wykazania neurogenezy, komórki są podwójnie znakowane BrdU plus NeuN, co wyraźnie wskazuje, że komórka narodziła się mniej więcej w czasie wstrzyknięcia BrdU i przetrwała by zróżnicować się w neuron. Przetrwanie komórki zależy od wielu czynników, wliczając zdolność komórki do utworzenia dendrytów, aksonu, syntezy neuroprzekaźnika, receptorów oraz nawiązania funkcjonalnych połączeń z innymi komórkami. Komórki, które nie nawiążą funkcjonalnych połączeń najprawdopodobniej umrą.

Możliwa jest ocena neurogenezy przy zastosowaniu metod innych niż BrdU i trytowanej tymidyny. Stosując techniki immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne, komórki można zabarwić na znaczniki niedojrzałych neuronów, które są przejściowe i obecne tylko w nowo uformowanych neuronach. Brandt i współpracownicy (2003) elegancko przedstawili tę metodę określając okresy czasu rozwoju, w których komórki ekspresjonują konkretne znaczniki podwójnie znakowane BrdU (Brandt et al., 2003). BrdU wciąż jest jedynym sposobem na odatowanie narodzin komórek, dlatego w celu ustalenia metody niezbędne było poznanie dokładnego wieku komórek. Ekspresja CRT plus dodatnich komórek BrdU była największa 1 do 2,5 tygodnia po wstrzyknięciu BrdU, a ilość podwójnie oznakowanych komórek była nieistotna w tygodniu 4, wykazując, że CRT jest przejściowe. Jeśli komórka wyekspresjonuje DCX lub CRT, komórka ta może zostać pozytywnie zidentyfikowana jako niedojrzały neuron, zatem szacunki dodatnich komórek DCX lub CRT w DG reprezentują szacunki neurogenezy.

Serotonergiczna inerwacja w zakręcie zębatym

Serotonina (5-HT) jest neuroprzekaźnikiem modulacyjnym w centralnym układzie nerwowym, ważnym przy regulacji życiowych funkcji mózgowych takich jak odżywianie (Lucki, 1992), termoregulacja (Feldberg & Myers, 1964), sen (Jouvet, 1967) oraz agresja (Sheard, 1969). Sygnalizacja serotonergiczna jest zaburzona w stanach psychopatologicznych, takich jak depresja (Pinder & Wieringa, 1993), zaburzenia odżywiania (Leibowitz & Shor-Posner, 1986) oraz niepokój.

W mózgu ssaczym, 5-HT jest wytwarzana przez neurony w jądrze szwu (RN - raphe nucleus), które projektują do wielu obszarów mózgu poprzez pęczek przyśrodkowy przodomózgowia (MFB - medial forebrain bundle) (Azmitia & Segal, 1978; Parent et al., 1981). Neurony z RN unerwiają praktycznie wszystkie obszary mózgu gęstą inerwacją występującą w HPC, korze mózgowej, prążkowiu, podwzgórzu, wzgórzu, przegrodzie i opuszce węchowej (Jacobs & Azmitia, 1992; Leger et al., 2001). Inerwacja włókien serotonergicznych dla obszarów w HPC jest zmienna (Moore & Halaris, 1975; Vertes et al., 1999; Bjarkam et al., 2003). DG jest unerwiony włóknami serotonergicznymi zarówno w warstwie drobinowej jak i we wnęce o szczególnie gęstej inerwacji projektującej do SGZ gdzie synapsuje z interneuronami (Halasy & Somogyi, 1993).

5-HT aktywuje piętnaście znanych receptorów, z których wiele jest wyrażonych w DG (El et al., 1989; Tecott et al., 1993; Vilaro et al., 1996; Djavadian et al., 1999; Clemett et al., 2000; Kinsey et al., 2001). Większość receptorów 5-HT wchodzi w interakcję z białkami G z wyjątkiem receptorów 5-HT3A, które są receptorami kanału jonowego bramkowanego przez ligandy (ligand-gated ion channel receptors). Receptory 5-HT3 (podtypy 5-HT3A i 5-HT3B) są bramkowanymi przez ligandy kanałami jonu Na+ a ich aktywacja prowadzi do depolaryzacji neuronów (Barnes & Sharp, 1999). Receptory z rodziny 5-HT1 (wliczając podtypy 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E oraz 5-HT1F) są sprzężone z białkiem Gi, które po aktywacji zmniejsza aktywność cyklazy adenylowej, zmniejszając tym samym tempo tworzenia cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP - cyclic adenosine monophosphate). Aktywacja receptorów 5-HT1 może prowadzić niebezpośrednio do otwarcia kanałów K+, zwiększając tym samym konduktancję błony komórkowej dla jonów K+. Aktywacja receptorów 5-HT4, 5-HT6, 5-HT7, jest sprzężona z białkami GS, które mają efekt przeciwny. Zwiększają one aktywność cyklazy adenylowej, zwiększają tempo tworzenia cAMP i zmniejszają konduktancję K+ (Thomas et al., 2000; Raymond et al., 2001). Receptory 5-HT2 (wliczając podtypy 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C) są sprzężone z białkami Gq i aktywują fosfolipazę C (PLC - phospholipase C), zwiększając tempo tworzenia trifosforanu inozytolu (IP3 - inositol triphosphate) oraz diacyloglicerolu prowadząc do zwiększonego tworzenia kinazy białkowej C (PKC - protein kinase C) (Kurrasch-Orbaugh et al., 2003; Ananth et al., 1987).

Serotonina i neurogeneza w zakręcie zębatym

Chociaż kilka czynników reguluje tempem generowania nowych komórek w dorosłym DG, jednym z najważniejszych znanych czynników jest 5-HT. Malberg i współpracownicy stwierdzili, że zwiększone poziomy 5-HT skutkowały zwiększonym tempem proliferacji progenitorów neuronowych w DG (Malberg et al., 2000). Podanie 5,7-dihydroksytryptaminy (5,7-DHT), serotonergicznej neurotoksyny do RN przyczyniło się do zniszczenia aksonów i komórek serotonergicznych i spowodowało zmniejszenie liczby komórek znakowanych BrdU w DG (Brezun & Daszuta, 1999). Lezja 5,7-DHT skutkowała około 60% zmniejszeniem serotonergicznej inerwacji do DG, co trwało przez jeden miesiąc. Po dwóch miesiącach, zaobserwowana została reinerwacja do DG wraz z wyrastaniem serotonergicznych aksonów, tak że w trzecim miesiącu nie było zauważalnej różnicy między 5,7-DHT a nosicielem w nowo wytworzonych komórkach lub w inerwacji serotonergicznej (Brezun & Daszuta, 2000).

W regulację neurogenezy w DG zaangażowanych jest wiele receptorów serotonergicznych. W warunkach invitro, gdy agonista receptora 5-HT1A, 8-OH-DPAT został dodany do podłoża, w którym obecne były kulturowane fibroblasty transfekowane receptorem 5-HT1A, tempo podziału komórkowego wzrosło (Varrault et al., 1992). Invivo, antagoniści receptora 5-HT1A (NAN-190, p-MPPI oraz WAY-100635) zmniejszyli ilość progenitorów w DG średnio o 30% (Radley & Jacobs, 2002) a wstrzyknięcia agonistów receptorów 5-HT1A zwiększyły ilość BrdU dodatnich komórek w DG (Santarelli et al., 2003). Podobnie, Banasr i współpracownicy wykazali, że różni agoniści receptora 5-HT1 zwiększają ilość komórek znakowanych BrdU w warstwie podziarnistej. Ostre podanie agonisty receptora 5-HT2A/C, 2,5-dimetoksy-4-jodoamfetaminy (DOI), agonisty receptora 5-HT2C, RO 600175, oraz antagonisty receptora 5-HT2C, SB 206553 nie wywarło wpływu na proliferację komórkową w HPC, podczas gdy antagonista receptora 5-HT2A/C, ketanserin wytworzył 63% spadek w przyłączaniu BrdU (Banasr et al., 2004). Ostatnie badanie stwierdziło, że ostry ketanserin zmniejszył proliferację, podczas gdy ketanserin przewlekły zwiększył proliferację w DG (Jha et al., 2008). Nie zaobserwowano żadnego wpływu na proliferację w DG po podaniu ostrym albo raz dziennie przez siedem kolejnych dni (przewlekle) DOI albo dietyloamidu kwasu lizergowego (LSD) (Jha et al., 2008).

Receptor 5-HT2A zaangażowany jest w regulację BDNF w HPC (Vaidya et al., 1997). DOI, sam, i w połączeniu z selektywnymi antagonistami receptorów 5-HT2A i 5-HT2C zmniejszył ekspresję BDNF mRNA w HPC. Co ciekawe, zmniejszenie ekspresji w BDNF mRNA zostało zablokowane antagonistą receptora 5-HT2A lecz nie antagonistą receptora 5-HT2C, co wskazuje na udział receptora 5-HT2A w regulowaniu ekspresji BDNF. W dodatku, wywołana stresem redukcja ekspresji BDNF w HPC została zablokowana antagonistą receptora 5-HT2A/C (Vaidya et al., 1997).

Psilocybina

Psilocybina (4-fosforyloksy-N,N-dimetylotryptamina) jest głównym aktywnym czynnikiem w "magicznych grzybach" i jest skategoryzowana jako halucynogen indolowy. Po raz pierwszy wyizolowana przez Alberta Hofmanna, w 1957, z Psilocybe mexicana, grzyba z Ameryki Środkowej, psilocybina została następnie wyprodukowana syntetycznie w 1958 (Hofmann et al., 1958a; Hofmann et al., 1958b). Psilocybina jest konwertowana do aktywnego metabolitu psylocyny (4-hydroksy-N,N-dimetylotryptaminy), która może wytworzyć niektóre z psychoaktywnych efektów psilocybiny. Chemiczna struktura psilocybiny (C12H17N2O4P) i metabolit psylocyna (C12H16N2O) są podobne do 5-HT (C10H12N2O), głównego neuroprzekaźnika, na który wpływają (zobacz Rycina 1,3).

Ryc. 1,3 - Chemiczna struktura psilocybiny, psylocyny i serotoniny.

Badania invivo na myszach wykazały, że LD50 psilocybiny poprzez podanie dożylne wynosi 280 mg/kg (Cerletti & Konzett, 1956; Cerletti, 1959). Autonomiczne efekty 10 mg/kg/sc u myszy, szczurów, królików, kotów i psów obejmują rozszerzenie źrenic, piloreksję, nieregularności w rytmie serca i oddechu oraz skutki hiperglikemiczne i hipertoniczne (Cerletti & Konzett, 1956; Cerletti, 1959). Skutki te zostały zinterpretowane jako syndrom pobudzający spowodowany stymulacją współczulnego układu nerwowego z jednym dużym wyjątkiem, którym jest brak hiperlokomocji (Monnier, 1959).

Psilocybina wywiera wpływ psychoaktywny poprzez zmianę neuroprzekaźnictwa serotonergicznego, wiążąc się z receptorami podtypów 5-HT1A, 5-HT1D, 5-HT2A oraz 5-HT2C (Passie et al., 2002). Psilocybina wiąże się z receptorem 5-HT2A (Ki=6nM) z wysokim powinowactwem i w o wiele mniejszym stopniu z podtypem receptora 5-HT1A (Ki=190 nM) (McKenna et al., 1990). Jednakże psilocybina posiada niższe powinowactwo z receptorami 5-HT2A i 5-HT2C w porównaniu z dietyloamidem kwasu lizergowego (LSD), podobnego halucynogenu indolowego (Nichols, 2004). W przeciwieństwie do LSD, psilocybina ma bardzo niskie powinowactwo z receptorami DA i tylko niezwykle wysokie dawki wpływają na receptory NE. Wykazano, że psilocybina wywołuje u ludzi psychozy schizofrenopodobne, zjawisko przypisywane działaniu psilocybiny poprzez działanie receptora 5-HT2A. Dokładniej, ochotnicy zostali wstępnie potraktowani ketanserinem, antagonistą receptora 5-HT2A/C, następnie podano im 0,25 mg/kg p.o. psilocybiny, i psychozomimetyczne efekty psilocybiny zostały całkowicie zablokowane (Vollenweider et al., 1998). Ponieważ zablokowanie receptora 5-HT2A zapobiegło psychotropowemu wpływowi psilocybiny, wydaje się, że działania psilocybiny są pośredniczone poprzez aktywację receptorów 5-HT2A. Niedawne badanie testowało kontrolę bodźców wywołanych psilocybiną i stwierdziło, że antagoniści receptora 5-HT2A uniemożliwiły szczurom rozpoznanie psilocybiny w zadaniu odróżniania leku, efekt, który nie został zaobserwowany przy antagonistach receptora 5-HT1A (Winter et al., 2007). Codziennie powtarzane podawanie psilocybiny wybiórczo regulowało w dół receptory 5-HT2A w szczurzym mózgu (Buckholtz et al., 1990; Buckholtz et al., 1988; Buckholtz et al., 1985). Psilocybina wiąże się z receptorem 5-HT2A i stymuluje kwas arachidonowy a w konsekwencji szlak PI, skutkując aktywacją PKC (Kurrasch-Orbaugh et al., 2003). Rozprawa ta starała się ocenić zaangażowanie receptora 5-HT2A w regulację neurogenezy hipokampowej i naukę zależną od hipokampa.

Konkretne cele

Niniejsze studium przebadało rolę receptora 5-HT2A w hipokampowej neurogenezie i nauce zależnej od hipokampa. Wpływ ostrych i przewlekłych agonistów i antagonistów receptora 5-HT2A na przetrwanie i fenotypowy los komórek progenitorowych w DG został oceniony przy pomocy technik immunofluorescencyjnych. Ponadto do oceny uczenia się i pamięci wykorzystany został wpływ ostrej psilocybiny na śladowe warunkowanie strachowe.

Konkretny cel 1

Ocenić wpływ ostrych agonistów i antagonistów receptora 5-HT2A na przetrwanie i fenotypowy los hipokampowych komórek progenitorowych. Założono, że psilocybina i 251-NBMeO, dwaj agoniści receptora 5-HT2A dodatnio reguluje neurogenezę w DG HPC, a ketanserin, agonista receptora 5-HT2A/C reguluje w dół hipokampową neurogenezę.

Konkretny cel 2

Wyjaśnić czy psilocybina wpływa na uczenie się i pamięć przy zastosowaniu paradygmatu śladowego warunkowania strachowego. Postawiono hipotezę, że ostre wystawienie na działanie psilocybiny zwiększałoby naukę zależną od hipokampa a ketanserin osłabiałby uczenie się w zadaniu śladowego warunkowania strachowego.

Rozdział II - Zaangażowanie receptora 5-HT2A przy regulowaniu dojrzałej neurogenezy w hipokampie myszy

Streszczenie

Wiadomo, że selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRIs) stymulują wytwarzanie nowych neuronów w hipokampie (HPC) zwiększając synaptyczne stężenie serotoniny (5-HT). Opóźnienie pojawienia się efektów antydepresyjnych koresponduje z czasem potrzebnym do wytworzenia nowych neuronów. Jednakże, nie jest jasne, które z wielu receptorów serotonergicznych w HPC są odpowiedzialne za zwiększoną neurogenezę. Niniejsze badanie ocenia wpływ ostrego i przewlekłego podania agonistów 5-HT2A, psilocybiny i 251-NBMeO oraz antagonistów 5-HT2A/C, ketanserinu, na neurogenezę hipokampa. By zbadać wpływ ostrego podania leku, myszy otrzymywały pojedynczy zastrzyk różnych dawek psilocybiny, 251-NBMeO, ketanserinu i soli fizjologicznej przed zastrzykami i.p. z 75 mg/kg bromodeoksyurydyny (BrdU) przez 4 kolejne dni, po których przeprowadzono eutanazję dwa tygodnie później. Przy podawaniu przewlekłym, cotygodniowo wymierzano 4 zastrzyki psilocybiny, ketanserinu lub soli fizjologicznej w ciągu jednego miesiąca. W dniach następujących po wstrzyknięciu leku, myszy otrzymywały zastrzyk z 75 mg/kg BrdU i były poddawane eutanazji dwa tygodnie po ostatnim wstrzyknięciu leku. Bezstronne oszacowania komórek BrdU+ i BrdU/NeuN+ w zakręcie zębatym (DG) ujawniły istotne zmniejszenie zależne od dawki w poziomie neurogenezy po ostrym podaniu agonisty lub antagonisty receptora 5-HT2A. Co ciekawe, przewlekłe podawanie psilocybiny zwiększyło ilość nowopowstałych neuronów w DG, podczas gdy antagonista stłumił hipokampową neurogenezę, sugerując, że receptor 5-HT2A zdaje się być zaangażowany w regulację neurogenezy hipokampa.

Wprowadzenie

Dowody sugerują, że neurogeneza zachodzi przez cały okres życia w dwóch konkretnych regionach dorosłego mózgu, w strefie okołokomorowej (SVZ - subventricular zone) oraz w strefie podziarnistej (SGZ - subgranular zone) zakrętu zębatego (Altman J, 1962; Altman & Das, 1965; Altman J, 1969). Na proliferację i przetrwanie neuralnych progenitorów w dorosłym HPC można wpłynąć różnorodnymi bodźcami, wliczając stres, wiek, aktywność fizyczną i depresję (Gould et al., 1992; Kempermann et al., 1998; Van et al., 1999b; Malberg et al., 2000). Leki antydepresyjne, takie jak selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRIs) wzmacniają wytwarzanie nowonarodzonych neuronów w DG hipokampa (Malberg et al., 2000). Jednakże efekt ten właściwy jest podawaniu przewlekłemu (14 dni lub dłużej) zwiększającemu neurogenezę, lecz nie leczeniu ostremu (Malberg et al., 2000). Co ciekawe, następujące opóźnienie w pojawieniu się efektów antydepresyjnych koresponduje z czasem potrzebnym na wytworzenie nowych neuronów (Santerelli et al., 2003), sugerując, że zwiększenie neurogenezy może pośredniczyć w zachowaniowym wpływie antydepresantów.

Wymóg przewlekłego podawania leków antydepresyjnych by zwiększyć neurogenezę wynika prawdopodobnie z wielu czynników. Leczenie antydepresyjne podregulowało ekspresję neurotropowego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF - brain-derived neurotrophic factor) w HPC (Nibuya et al., 1995). Myszy ze znokautowanym BDNF miały obniżone poziomy neurogenezy w DG (Lee et al., 2002) a wlewy BDNF do komór bocznych wywołały neurogenezę zapoczątkowaną w SVZ (Pencea et al., 2001).

Udział 5-HT w regulacji neurogenezy może być pośredniczony przez różne podtypy receptora 5-HT wyrażone na komórkach mikrownęki neurogennej (Barnes & Sharp, 1999). Receptor 5-HT2A jest zaangażowany w regulację BDNF w HPC (Vaidya et al., 1997). 2,5-dimetoksy-4-jodoamfetamina (DOI), agonista receptora 5-HT2A/C zmniejszył ekspresję BDNF mRNA w HPC (Vaidya et al., 1997). Co ciekawe, zmniejszenie ekspresji BDNF mRNA zostało zablokowane przez antagonistę receptora 5-HT2A lecz nie przez antagonistę receptora 5-HT2C, angażując receptor 5-HT2A w regulację ekspresji BDNF w HPC (Vaidya et al., 1997). Ostre podanie DOI, RO 600175, agonisty receptora 5-HT2C, lub SB-206553, antagonisty receptora 5-HT2C, nie miało wpływu na proliferację komórkową, podczas gdy ketanserin, antagonista receptora 5-HT2A/C, wytworzył 63% spadek w przyłączaniu BrdU (Banasr et al., 2004). Ostatnie badania stwierdziły, że ostry ketanserin zmniejszył proliferację, podczas gdy przewlekły ketanserin zwiększył proliferację w DG (Jha et al., 2008). Brak wpływu na proliferację w DG został zaobserwowany po podaniu DOI lub dietyloamidu kwasu lizergowego (LSD), czy to ostrego czy raz dziennie przez siedem kolejnych dni (przewlekle) (Jha et al., 2008). Jednakże, codzienne dawki LSD lub psilocybiny wytworzyły szybką tolerancję na lek i poskutkowały selektywną regulacją w dół receptora 5-HT2A (Buckholtz et al., 1990; Buckholtz et al., 1985). Dlatego w celu zbadania roli receptora 5-HT2A w regulacji neurogenezy hipokampowej niniejsze badanie oszacowało wpływ na neurogenezę hipokampową ostrego i powtarzanego okresowego podawania agonistów 5-HT2A oraz antagonisty 5-HT2A/C, ketanserinu.

Materiały i metody

Badane obiekty

Samice myszy C57BL/6J (30-40g), trzymano w standardowych klatkach laboratoryjnych i pozostawiono w spokoju przez 1 tydzień po przybyciu do zwierzętarni. Wszystkie myszy miały nieograniczony dostęp do wody i karmy laboratoryjnej i były trzymane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności w cyklu 12:12 światło/mrok, z włączaniem światła o 7:00 rano. Spełnione zostały wszystkie wytyczne Narodowego Instytutu Zdrowia odnośnie Opieki i Stosowania Zwierząt Laboratoryjnych (National Institutes of Health, 2002).

Leki

251-NBMeO został zsyntetyzowany w laboratorium dr Davida Nicholsa (Braden et al., 2006). Psilocybina została dostarczona przez dr Francisco Moreno z Uniwersytetu Arizony. Ketanserin (+)-sól winianu (#S006, St. Louis, MO) oraz 5-bromo-2'-deoksyurydyna (#B5002, St. Louis, MO) zostały dostarczone przez Sigma-Aldrich Inc.

Procedura ogólna

Ostre podanie: Łącznie 48 myszy C57BL/6 otrzymało pojedynczy zastrzyk z 0,1 mg/kg psilocybiny (n=6), 0,5 mg/kg psilocybiny (n=6), 1,0 mg/kg psilocybiny (n=6), 0,1 mg/kg 251-NBMeO (n=6), 0,3 mg/kg 251-NBMeO (n=6), 1,0 mg/kg 251-NBMeO (n=6), 1,0 mg/kg ketanserinu (n=6) lub soli fizjologicznej (n=6). Myszy otrzymywały dootrzewnowy (i.p.) zastrzyk z 75 mg/kg BrdU raz dziennie przez 4 dni po podaniu leku i zostały poddane eutanazji dwa tygodnie po ostatnim zastrzyku leku. Myszy poddano eutanazji przy pomocy nembutalu, następnie perfundowano przezsercowo 0,9% solą fizjologiczną a następnie 4% paraformaldehydem. Mózgi były przechowywane w 4% paraformaldehydzie, przeniesione do 20% roztworu sacharozy i sekcjonowane koronalnie przy pomocy kriostatu (Leica, Germany) na 30 µm w seriach 1:6 oraz przechowywane w 24 dołkowych płytkach w krioprotektorze przy -20°C. Powtarzane podawanie okresowe: Łącznie 31 myszy C57BL/6 otrzymało 4 zastrzyki i.p. albo z 0,5 mg/kg psilocybiny (n=6), 1,0 mg/kg psilocybiny (n=7), 1,5 mg/kg psilocybiny (n=6), 1,0 mg/kg ketanserinu (n=6) albo z 0,9% roztworu soli fizjologicznej (n=6) w ciągu jednego miesiąca w dniach 1, 8, 15 oraz 22. Każdego dnia po podaniu leku wstrzykiwano 75 mg/kg BrdU i.p. Wszystkie myszy poddano eutanazji dwa tygodnie po ostatnim zastrzyku lekowym według powyższych procedur.

Immunofluorescencja

Dla podwójnego znakowania komórek progenitorowych w DG, swobodnie pływające wycinki zostały zdenaturowane przy pomocy 2N HCl i zneutralizowane w buforze boranowym 0,15M, a następnie przepłukane w PBS. Tkanka została zablokowana w PBS+ (PBS, 10% normalnej surowicy koziej, 1% 100x Tryton X, 10% BSA) przez 1 godzinę w 4°C i inkubowana przez 48 godzin w 4°C w koktajlu z przeciwciał szczurzego monoklonalnego anty-NeuN (Chemicon, 1:100) w PBS. Wycinki zostały przemyte w PBS i inkubowane we wtórnym koktajlu z przeciwciał z koziego antyszczurzego IgG Alexa Fluor 594 (1:1000, Invitrogen, Eugene OR) plus z koziego antymysiego (1:400, Invitrogen) i pokryte podłożem montażowym Vectorshield (Invitrogen).

Kwantyfikacja

Do kwantyfikacji podwójnie znakowanych komórek przy pomocy immunofluorescencji, oszacowanych zostało wiele komórek oznakowanych BrdU+ i BrdU/NeuN+ przy zastosowaniu co szóstego wycinka pobranego z całego DG (co każde 180 mikronów). By uniknąć zliczania komórek częściowych, zastosowano modyfikację do metody dysektora optycznego, tak że komórki na górnych i dolnych planach nie były zliczane. Ilość komórek BrdU+ zliczona na każdym co szóstym wycinku była mnożona przez 6 by otrzymać łączną ilość komórek BrdU+ lub BrdU/NeuN+ w DG (Shors et al. 2002). Znakowanie dodatnie zostało zweryfikowane mikroskopem konfokalnym (Zeiss).

Projekt i analizy

Do ocenienia ostrego i przewlekłego wpływu agonistów i antagonistów receptora 5-HT2A na neurogenezę hipokampową wykorzystano oddzielne jednoczynnikowe analizy wariancji (ANOVA). Dla ostrego podania leku wykorzystana została oddzielna jednoczynnikowa ANOVA by określić wpływ Leku [Psilocybina (roztwór soli fizjologicznej, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg), 251-NBMeO (roztwór soli fizjologicznej, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg)] oraz zastosowano dwustronne (two-tailed) testy-t (roztwór soli fizjologicznej, ketanserin 0,1 mg/kg) by ustalić różnice przetrwania komórek i neurogenezy. Dla przewlekłego podania leku zastosowana została oddzielna jednoczynnikowa ANOVA by ustalić wpływ Dawki (roztwór soli fizjologicznej, 0,5 mg/kg Psilocybiny, 1,0 mg/kg Psilocybiny, 1,5 mg/kg Psilocybiny, 1,0 mg/kg ketanserinu) na przetrwanie komórek i neurogenezę. Podczas gdy do wyizolowania wpływu Leku zastosowane zostały odpowiednie analizy post hoc, takie jak Bonferroniego. Wszystkie analizy statystyczne zostały określone jako istotne przy poziomie alfa 0,05.

Wyniki

Wpływ ostrego podania agonistów i antagonistów receptorów 5-HT2A invivo na przetrwanie komórek i neurogenezę w hipokampie

W celu zbadania wpływu ostrego podania psilocybiny na przetrwanie komórek i neurogenezę, myszom (n=6-7 na warunek) wstrzyknięto psilocybinę (0,1, 0,5 lub 1,0 mg/kg), 251-NBMeO (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg), ketanserin (1,0 mg/kg) lub 0,9% roztwór soli fizjologicznej, a następnie otrzymywały 75 mg/kg BrdU raz dziennie przez 4 dni następujące po podaniu leku po czym wykonano eutanazję dwa tygodnie po ostatnim wstrzyknięciu leku. Jednoczynnikowa ANOVA wykryła istotne różnice w całkowitej ilości przetrwałych komórek BrdU+ w DG w wyniku ostrego potraktowania psilocybiną [F(3,20)=6,64, p=0,003]. Jak widać na Rycinie 2,1A, istotny spadek w ilości przetrwałych komórek BrdU+ zaobserwowano po 1,0 mg/kg psilocybiny w porównaniu do roztworu soli fizjologicznej (oznaczone *).

Ryc. 2,1 - Wpływ ostrego podania psilocybiny na neurogenezę hipokampa. Myszom (n=6 na warunek) wstrzyknięto psilocybinę (0,1, 0,5 lub 1,0 mg/kg) lub roztwór soli fizjologicznej, następnie otrzymywały 75 mg/kg BrdU raz dziennie przez 4 dni po podaniu leku, po czym wykonanno eutanazję dwa tygodnie po wstrzyknięciu leku. A) Łączna ilość komórek BrdU+ w DG była istotnie zmniejszona po pojedynczym wstrzyknięciu 1,0 mg/kg psilocybiny (p<0,05). B) Ostre podanie 1,0 mg/kg psilocybiny istotnie zmniejszyło ilość komórek BrdU/NeuN+ w porównaniu do roztworu soli fizjologicznej (p<0,05). Dane te sugerują, że ostre podanie 1,0 mg/kg psilocybiny, agonisty 5-HT2A, wyregulowało w dół neurogenezę w DG hipokampa. * wskazuje na istotną różnicę od soli fizjologicznej.

Fenotypowy los komórek, które przetrwały został określony immunofluorescencyjnym znakowaniem BrdU i NeuN. Jednoczynnikowa ANOVA ujawniła istotny wpływ dawki na ilość podwójnie znakowanych neuronów w DG [F(3,20)=10,26, p=0,0003]. Jak widać na Rycinie 2,1B, ostre podanie 1,0 mg/kg psilocybiny istotnie zmniejszyło ilość komórek BrdU/NeuN+ w porównaniu z roztworem soli fizjologicznej (p<0,05). Dane te sugerują, że ostre podanie 1,0 mg/kg psilocybiny, agonisty 5-HT2A, wyregulowało w dół neurogenezę w DG.

Ryc. 2,2 - Reprezentatywne fotomikrografie ukazujące wpływ ostrej psilocybiny na neurogenezę hipokampa. Komórki NeuN+ (z lewej), komórki BrdU+ (środek) oraz komórki NeuN/BrdU+ (z prawej). Roztwór soli fizjologicznej (A-C), 0,1 mg/kg psilocybiny (D-F), 0,5 mg/kg psilocybiny (G-I) oraz 1,0 mg/kg psilocybiny (J-L). Skala = 50 µm.

Jednoczynnikowa ANOVA wykryła istotne różnice w całkowitej ilości ocalałych komórek BrdU+ w DG w wyniku ostrego potraktowania 251-NBMeO [F(3,20)=9,00, p=0,0004]. Zaistniał istotny spadek w ilości ocalałych komórek BrdU+ po ostrym podaniu 0,1, 0,3 i 1,0 mg/kg 251-NBMeO w porównaniu do soli fizjologicznej (zobacz rycina 2,3A, oznaczone *).

W dodatku, wystąpił istotny wpływ leku na ilość podwójnie znakowanych neuronów w DG [F(3,20=3,00, p=0,03]. Jak widać na Rycinie 2,3B, 1,0 mg/kg 251-NBMeO istotnie zmniejszyło ilość nowopowstających neuronów w DG w porównaniu do roztworu soli fizjologicznej (p<0,05, oznaczone *). Dane te sugerują, że ostre podanie selektywnego agonisty receptora 5-HT2A, 251-NBMeO, osłabiło neurogenezę hipokampa.

Ryc. 2,3 - Wpływ selektywnego agonisty receptora 5-HT2A, 251-NBMeO na neurogenezę hipokampa. Myszom (n=6 na warunek) wstrzyknięto 251-NBMeO (0,1, 0,3, 1,0 mg/kg) lub roztwór soli fizjologicznej, następnie otrzymywały 75 mg/kg BrdU raz dziennie przez 4 dni po podaniu leku, po czym wykonano eutanazję dwa tygodnie po wstrzyknięciu leku. A) Po podaniu 251-NBMeO (p<0,05) nastąpił istotny spadek całkowitej ilości komórek BrdU+ w DG. B) Ilość nowopowstałych neuronów była istotnie zmniejszona po 1,0 mg/kg 251-NBMeO w porównaniu do roztworu soli fizjologicznej (p<0,05), sugerując, że ostre podanie agonisty receptora 5-HT2A wyregulowało w dół neurogenezę w DG hipokampa.
* wskazuje istotną różnicę od roztworu soli fizjologicznej.

Ryc. 2,4 - Reprezentatywne fotomikrografie ukazujące wpływ selektywnego agonisty receptora 5-HT2A 251-NBMeO na neurogenezę hipokampa. Komórki NeuN+ (z lewej), komórki BrdU+ (środek) oraz komórki NeuN/BrdU+ (z prawej). Roztwór soli fizjologicznej (A-C), 0,1 mg/kg 251-NBMeO (D-F), 0,3 mg/kg 251-NBMeO (G-I) oraz 1,0 mg/kg 251-NBMeO (J-L). Skala = 100 µm.

Co ciekawe, ostre podanie ketanserinu, agonisty receptora 5-HT2A/C wytworzyło podobny wpływ na neurogenezę, co wysokie dawki agonistów receptora 5-HT2A. Jak widać na rycinie 2,5, łączna ilość komórek BrdU+ w DG została istotnie zmniejszona po 1,0 mg/kg ketanserinu [t(10)=3,0, p=0,008], sugerując, że receptor 5-HT2A/C jest zaangażowany w regulację przetrwania komórek w HPC. Ponadto, ostry ketanserin zmniejszył całkowitą ilość dodatnich komórek BrdU/NeuN w porównaniu z roztworem soli fizjologicznej [t(10)=3,0, p=0,02] wykazując, że antagonizm receptora 5-HT2A/C ujemnie regulował ilość nowopowstałych neuronów wytworzonych w DG hipokampa.

Ryc. 2,5 - Ostre podanie ketanserinu, antagonisty receptora 5-HT2A/C, ujemnie regulowało przetrwanie komórkowe i neurogenezę w HPC. Myszom (n=6 na warunek) wstrzyknięto 1,0 mg/kg ketanserinu lub soli fizjologicznej, następnie otrzymywały 75 mg/kg BrdU raz dziennie przez 4 dni po leku, po czym wykonano eutanazję dwa tygodnie po wstrzyknięciu leku. Ketanserin obniżył całkowitą ilość komórek BrdU+ (A) oraz dodatnich BrdU/NeuN (B), sugerując, że antagonizm receptora 5-HT2A/C ujemnie regulował przetrwanie komórkowe i neurogenezę w HPC.
Ryc. 2,6 - Reprezentatywne fotomikrografie ukazujące wpływ ketanserinu, antagonisty receptora 5-HT2A/C, na neurogenezę w zakręcie zębatym. Komórki NeuN+ (z lewej), komórki BrdU+ (środek) oraz komórki NeuN/BrdU+ (z prawej). Roztwór soli fizjologicznej (A-C), 1,0 mg/kg ketanserinu (D-F). Skala = 100 µm.

Wpływ powtarzanego okresowego podawania psilocybiny na przetrwanie komórek progenitorowych i neurogenezę w hipokampie

W celu zbadania wpływu powtarzanego okresowego podawania psilocybiny na przetrwanie komórek, myszom (n=6-7 na warunek) wstrzykiwano psilocybinę (0,5, 1,0, lub 1,5 mg/kg), 1,0 mg/kg ketanserinu lub 0,9% roztworu soli fizjologicznej raz w tygodniu przez 4 tygodnie. Każdego dnia po podaniu leku, myszom podawano 75 mg/kg BrdU i poświęcano je dwa tygodnie po ostatnim wstrzyknięciu leku. ANOVA nie udało się ujawnić różnic w całkowitej ilości komórek BrdU+ w DG w wyniku powtarzanego okresowego traktowania lekiem [F(4,26=2,20, p=0,09]. Jak widać na Rycinie 2,7A, po wysokich dawkach psilocybiny zaobserwowano tendencję ku wzrostowi ilości przetrwałych komórek.

Fenotypowy los przetrwałych komórek został ustalony poprzez znakowanie immunofluorescencyjne BrdU i NeuN. ANOVA ujawniła istotny wpływ Dawki na ilość podwójnie znakowanych neuronów w DG [F(4,26)=3,15, p=0,02]. Jak widać na Rycinie 2,7B, przewlekłe podawanie 1,5 mg/kg psilocybiny istotnie zwiększyło ilość komórek BrdU/NeuN+ w porównaniu do soli fizjologicznej i ketanserinu (p<0,05) (oznaczone *). Dane te sugerują, że powtarzane okresowe podawanie psilocybiny, agonisty 5-HT2A podregulowało neurogenezę w DG hipokampa.

Ryc. 2,7 - Wpływ powtarzanego okresowego podawania psilocybiny na neurogenezę hipokampa. Myszom (n=6-7 na warunek) wstrzykiwano psilocybinę (0,5, 1,0, lub 1,5 mg/kg), 1,0 mg/kg ketanserinu lub roztworu soli fizjologicznej raz w tygodniu przez 4 tygodnie. Każdego kolejnego dnia po podaniu leku, myszom podawano 75 mg/kg BrdU i poświęcano je dwa tygodnie po ostatnim zastrzyku leku. A) Łączna ilość komórek BrdU+ w DG nie różni się w wyniku powtarzanego okresowego traktowania lekiem, jednakże, tendencja ku wzrostowi ilości przetrwałych komórek została zaobserwowana po wysokich dawkach psilocybiny. B) Powtarzane okresowe podawanie 1,5 mg/kg psilocybiny istotnie zwiększyło ilość komórek BrdU/NeuN+ w porównaniu z roztworem soli fizjologicznej i ketanserinu (p<0,05). Dane te sugerują, że powtarzane okresowe podawanie wysokich dawek psilocybiny, agonisty 5-HT2A podregulowało neurogenezę w DG.
* oznacza istotną różnicę od roztworu soli fizjologicznej i ketanserinu.
Ryc. 2,8 - Reprezentatywne fotomikrografie ukazujące wpływ powtarzanego okresowego podawania psilocybiny lub ketanserinu na neurogenezę w DG. Komórki NeuN+ (z lewej), komórki BrdU+ (środek) oraz komórki NeuN/BrdU+ (z prawej). Roztwór soli fizjologicznej (A-C), 0,5 mg/kg psilocybiny (D-F), 1,0 mg/kg psilocybiny (G-I), 1,5 mg/kg psilocybiny (J-L), oraz 1,0 mg/kg ketanserinu (M-O). Skala = 100 µm.

Omówienie

Niniejsze badanie ilustruje zaangażowanie receptora 5-HT2A w regulację neurogenezy w DG hipokampa. Ostre podanie niskich dawek psilocybiny (0,1 i 0,5 mg/kg) nie zmienia neurogenezy, jednakże wyższe dawki psilocybiny (1,0 mg/kg) zmniejszają neurogenezę dwa tygodnie po wystawieniu na działanie leku (Rycina 2,1). Ponadto, ostre podanie silnego agonisty receptora 5-HT2A 251-NBMeO (Rycina 2,3) oraz antagonisty receptora 5-HT2A/C ketanserinu (Rycina 2,5) zmniejszyło hipokampową neurogenezę. Ostry ketanserin (1-5 mg/kg) podany w ciągu 4 godzin od poświęcenia zmniejszył ilość komórek BrdU+ w DG, wskazując na zmniejszenie proliferacji komórkowej (Banasr et al., 2004; Jha et al., 2008). Niniejsze badanie poszerza te ustalenia wykazaniem, że ostry ketanserin zmniejsza ilość komórek BrdU+ i BrdU/NeuN+ 2 tygodnie po podaniu leku, wskazując na zredukowanie przetrwania komórek i neurogenezy po wystawieniu na działanie ostrego ketanserinu.

Obecne badanie informuje, że powtarzane okresowe podawanie wysokich dawek psilocybiny (1,5 mg/kg) zwiększyło neurogenezę w DG (zobacz rycina 2,7). Ostatnie badanie sprawdziło wpływ przewlekłego podawania DOI, LSD oraz ketanserinu na ilość komórek BrdU+ w DG (Jha et al. 2008). Sprawozdają oni brak wpływu, po przewlekłym DOI lub LSD, na proliferację komórek progenitorowych lecz zaobserwowali wzrost ilości komórek BrdU+ w DG po przewlekłym ketanserinie. Istnieje kilka różnic metodologicznych między badaniami, które mogą odpowiadać różnym wynikom, mianowicie protokół podania leku, dawki podanych związków oraz protokół podania BrdU. Jha i współpracownicy podawali DOI (8 mg/kg), LSD (0,5 mg/kg) lub ketanserin (5 mg/kg) raz dziennie przez siedem kolejnych dni dla protokołu przewlekłego podawania leku (Jha et al., 2008). Obecne badanie podawało psilocybinę (0,5, 1,0, lub 1,5 mg/kg) albo ketanserin (1,0 mg/kg) 4 razy w ciągu jednego miesiąca, tak że zastrzyki dawano co tydzień. Kluczową okolicznością w naszym projekcie eksperymentalnym było ustalenie, że codzienne dawki LSD, psilocybiny lub innych agonistów receptora 5-HT2A wytwarzają szybką tolerancję na lek i powodują selektywne wyregulowanie w dół receptora 5-HT2A (Buckholtz et al., 1990; Buckholtz et al., 1985; Buckholtz et al., 1988). Jha i współpracownicy podawali BrdU (200 mg/kg) 2 godziny po ostatnim zastrzyku z DOI, LSD lub ketanserinu i poświęcali zwierzęta 24 godziny później (Jha et al., 2008). W obecnym badaniu, BrdU (75 mg/kg) została podana 24 godziny po każdym zastrzyku lekowym a myszy poświęcane były dwa tygodnie po ostatnim zastrzyku lekowym, tak że czas między pierwszym zastrzykiem BrdU a poświęceniem wynosił 6 tygodni. Pozwalało to ocenić neurogenezę, dając czas by komórki z odatowanymi narodzinami (oznakowane BrdU) dojrzały w dorosłe neurony.

Neurotropowy czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) został powiązany z plastycznością synaptyczną (Kang et al., 1997; Pang et al., 2004; Tyler et al., 2002) poprzez modulację formowania synapsy i rozwoju kolca dendrytycznego w HPC (Bamji et al., 2006; Tyler & Pozzo-Miller, 2001; Tyler & Pozzo-Miller, 2003). Przewlekłe podawanie agonistów 5-HT (wliczając SSRIs) podregulowuje ekspresję BDNF mRNA w HPC (Nibuya et al., 1995; Nibuya et al., 1996). Dowody sugerują, że receptor 5-HT2A jest zaangażowany w regulację BDNF w HPC (Vaidya et al., 1997). W szczególności DOI, agonista receptora 5-HT2A/C zmniejszał ekspresję BDNF mRNA w warstwie komórek ziarnistych DG lecz nie w podpolach CA hipokampa. Co ciekawe, zmniejszenie ekspresji BDNF mRNA zostało zablokowane antagonistą receptora 5-HT2A lecz nie antagonistą receptora 5-HT2C, wkluczając receptor 5-HT2A w regulację ekspresji BDNF (Vaidya et al., 1997).

Psilocybina i 251-NBMeO wywierają swe skutki poprzez wiązanie z receptorami 5-HT. Psilocybina wiąże się z receptorem 5-HT2A (Ki=6nM) z wysokim powinowactwem i w o wiele mniejszym stopniu z podtypem receptora 5-HT1A (Ki=190nM) (McKenna et al., 1990). Syntetyczna fenetyloamina 251-NBMeO wiąże się z receptorami 5-HT2A (Ki=0,044 nM) z niezwykle wysokim powinowactwem (Braden et al., 2006).

Receptory 5-HT2A są wysoce wyrażone w całym HPC w DG, we wnęce, w CA1 i CA3 oraz kolokalizowane są na neuronach GABAergicznych, komórkach piramidowych i ziarnistych (Cornea-Hebert et al., 1999; Morilak et al., 1993; Pompeiano et al., 1994; Shen & Andrade, 1998; Luttgen et al., 2004; Morilak et al., 1994). Agoniści receptora 5-HT2A stymulują kwas arachidonowy i w konsekwencji, szlak fosfoinozytydowy (PI - phosphoinositide) skutkując aktywacją białkowej kinazy C (PKC - protein kinase C) (Kurrasch-Orbaugh et al., 2003; Ananth et al., 1987). Elektrofizjologiczne dowody sugerują, że receptory 5-HT2A stymulują interneurony GABAergiczne w HPC (Shen & Andrade, 1998) a interneurony GABAergiczne we wnęce tworzą połączenia z komórkami progenitorowymi w SGZ (Wang et al., 2005). Gdy komórki progenitorowe mają mniej niż 2 tygodnie, GABAergiczne sygnały wejściowe wywierają pobudzający wpływ na komórki progenitorowe a gdy komórki ustanowią połączenie z synapsami glutaminergicznymi, interneurony GABAergiczne stają się hamujące (Wang et al., 2005; Zhao et al., 2006; Aimone et al., 2006). Biorąc pod uwagę, że agoniści receptora 5-HT2A podawani przewlekle regulują w dół ekspresję receptora, i dowód sugerujący, że receptor 5-HT2A pobudza interneurony GABAergiczne, które stymulują komórki progenitorowe w SGZ, można spodziewać się zmniejszenia neurogenezy po przewlekłej psilocybinie. Niniejsze badanie sprawozdaje wręcz przeciwnie, że wysokie dawki psilocybiny podregulowują neurogenezę. W oparciu o to odkrycie, prawdopodobnym jest zasugerowanie, że zaobserwowany wzrost neurogenezy można przypisać paradygmatowi podawania, w którym psilocybina była dawana 4 razy w ciągu jednego miesiąca, tak że zastrzyki były robione raz na tydzień. W tym paradygmacie podawania, zmiany w poziomach receptora mogły nie występować w stopniu, który występuje przy codziennej ekspozycji i dać tej bardzo plastycznej mikroniszy czas na dostosowanie się między ekspozycjami na lek.

Ukazane rezultaty dostarczyły dowodów na to, że receptor 5-HT2A jest zaangażowany w regulację neurogenezy hipokampa. Dane sugerują, że ostre podanie agonistów i antagonistów receptora 5-HT2A regulowało w dół neurogenezę w DG. Podczas gdy przewlekłe podawanie wysokich dawek agonistów receptora 5-HT2A zwiększa neurogenezę hipokampową w DG. Przyszłe badania powinny zbadać wpływ przewlekłego podawania psilocybiny i ketanserinu na neuroplastyczność i poziomy receptora 5-HT2A w HPC.

Podziękowania

Praca ta została wsparta przez Helen Ellis Research Endowment (JSR). Dziękuję dr Davidowi Nicholsowi za przekazanie selektywnego agonisty 5-HT2A 251-NBMeO oraz dr Francisco Moreno z Uniwersytetu Arizony oraz dr Rickowi Doblinowi z Multidyscyplinarnego Stowarzyszenia do Badań Psychedelicznych (MAPS - Multidisciplinary Association for Psychedelic Studies) za przekazanie psilocybiny.

Rozdział III - Wpływ psilocybiny na śladowe warunkowanie strachowe

Streszczenie

Aberracje w mózgowej neurotransmisji serotoniny (5-HT) biorą udział w zaburzeniach psychiatrycznych, wliczając niepokój, depresję oraz deficyty uczenia się i pamięci. Wiele z tych zaburzeń leczonych jest lekami, które sprzyjają dostępności 5-HT w synapsach. Jednakże nie jest jasne, które z receptorów 5-HT2A są zaangażowane w poprawy zachowaniowe. Niniejsze badanie miało na celu sprawdzić wpływ psilocybiny, agonisty receptora 5-HT2A na uczenie się zależne od hipokampa. Myszy otrzymały pojedynczy zastrzyk psilocybiny (0,1, 0,5, 1,0 lub 1,5 mg/kg), ketanserinu (antagonisty 5-HT2A/C lub roztworu soli fizjologicznej 24 godziny przed przyzwyczajeniem się do środowiska i późniejszym treningiem i badaniem pod kątem zadania warunkowania strachowego. Śladowe warunkowanie strachowe jest zadaniem zależnym od hipokampa, w którym prezentacja bodźca warunkowego (CS - conditioned stimulus) (dźwięku) jest oddzielona w czasie śladowym interwałem (trace interval) od bodźca bezwarunkowego (US - unconditioned stimulus) (wstrząsu). Wszystkie myszy wykształciły kontekstowe i sygnalizowane warunkowanie strachowe; jednakże, u myszy potraktowanych psilocybiną sygnalizowane warunkowanie strachowe wygasło o wiele szybciej niż u myszy potraktowanych solą fizjologiczną. Co ciekawe, myszy, którym podano ketanserin, antagonistę receptora 5-HT2A/C wykazały mniejszą reakcję na sygnalizowany strach niż myszy potraktowane solą fizjologiczną i psilocybiną. Przyszłe badania powinny przebadać czasowy wpływ ostrego i przewlekłego podania psilocybiny na zadania uczenia się zależne od hipokampa.

Wprowadzenia

Hipokamp (HPC) odgrywa kluczową rolę w zadaniach uczenia się, które obejmują czasowe kodowanie bodźców (Squire et al., 1992; Squire, 1992). Klasyczny paradygmat warunkowania śladowego wymaga przetwarzania czasowego, ponieważ bodziec warunkowy (CS) oraz bezwarunkowy (US) są oddzielone w czasie śladowym interwałem. Lezje w HPC zapobiegają warunkowaniu śladowemu, wskazując, że jest to zadanie zależne od hipokampa (McEchron et al., 1998; Weiss et al., 1999).

Układ serotonergiczny został powiązany z uczeniem zależnym od hipokampa. Podawanie inhibitorów wychwytu zwrotnego (5-HT) serotoniny (SSRIs) wytwarza zmiany wydajności w zadaniach uczenia, które wymagają HPC (Flood & Cherkin, 1987; Huang et al., 2004). W znokautowanym (KO) modelu mysim, myszy z głównym niedoborem 5-HT wykształciły podwyższone kontekstowe warunkowanie strachowe, które zostało odwrócone poprzez dokomorowomózgowe mikrozastrzyki 5-HT (Dai et al., 2008). Osłabienie uczenia w labiryncie wodnym Morrisa zostało zaobserwowane u myszy ze znokautowanym 5-HT1A wraz z zaburzeniami czynnościowymi w HPC (Sarnyai et al., 2000). Aktywacja receptorów 5-HT1A w przegrodzie przyśrodkowej zmienia kodowanie i konsolidację zadań pamięciowych zależnych od hipokampa (Koenig et al., 2008). W dodatku, dietyloamid kwasu lizergowego (LSD), agonista receptora 5-HT2A ułatwił uczenie odwrotnej dyskryminacji jasności (King et al., 1972; King et al., 1974).

Dowody sugerują, że wydajność w zadaniach uczenia się zależnych od hipokampa jest zależna od neurogenezy w zakręcie zębatym (DG) hipokampa (Van et al., 2002; Nilsson et al., 1999; Shors et al., 2001; Shors et al., 2002; Gould et al., 1999a; Gould et al., 1999c). Zostało to elegancko wykazane przez Shors i współpracowników poprzez potraktowanie zwierząt octanem metylazoksymetanolu (MAM - methylazoxymethanol acetate), środkiem antymitotycznym, który eliminuje populację komórek progenitorowych w DG przed przebadaniem myszy zadaniami uczenia się zależnymi i niezależnymi od hipokampa (Shors et al., 2001; Shors et al., 2002). Zwierzęta potraktowane MAM miały znacznie mniej komórek BrdU+ w strefie podziarnistej (SGZ - subgranular zone) w DG lecz nie wykazały zaburzenia w zadaniu nawigacji przestrzennej (zależnej od HPC) lub zadaniu warunkowania opóźnionego odruchu mrugania (niezależnego od HPC) wykazując, że populacja hipokampowych komórek progenitorowych nie jest niezbędna dla tych konkretnych zadań (Shors et al., 2002; Shors et al., 2001). W przeciwieństwie do tego, MAM poważnie zaburzył wydajność śladowego warunkowania strachowego i śladowego warunkowania mrugania, dostarczając dowodu na udział komórek progenitorowych z DG w klasycznym warunkowaniu śladowym (Shors et al., 2002; Shors et al., 2001). Neurogeneza hipokampowa jest w dodatku zależna od agonistów serotonergicznych. Wytwarzanie nowych neuronów w DG hipokampa zwiększają zwłaszcza SSRIs (Malberg et al., 2000; Santarelli et al., 2003).

Psilocybina, alkaloid tryptaminowy, wywiera efekty psychoaktywne poprzez zmianę neuroprzewodnictwa serotonergicznego (Passie et al., 2002). Psilocybina wiąże się z receptorem 5-HT2A (Ki=6 nM) z wysokim powinowactwem i w o wiele mniejszym stopniu z podtypem receptora 5-HT1A (Ki=190 nM) (McKenna et al., 1990). Receptory 5-HT2A są wysoce wyrażone w całym HPC w DG, we wnęce, CA1, oraz CA3 (Cornea-Hebert et al., 1999; Morilak et al., 1993; Pompeiano et al., 1994; Shen & Andrade, 1998; Luttgen et al., 2004; Morilak et al., 1994). Agoniści receptora 5-HT2A, wliczając psilocybinę, stymulują kwas arachidonowy (AA - arachidonic acid) a w konsekwencji szlak fosfoinozytydowy (PI - phosphoinositide) skutkując aktywacją białkowej kinazy C (PKC - protein kinase C) (Kurrasch-Orbaugh et al., 2003; Ananth et al., 1987). Elektrofizjologiczne dowody sugerują, że receptory 5-HT2A stymulują interneurony GABAergiczne w HPC (Shen & Andrade, 1998) a interneurony GABAergiczne we wnęce tworzą połączenia z komórkami progenitorowymi w SGZ (Wang et al., 2005).

Niniejsze badanie miało na celu zbadanie wpływu agonisty receptora 5-HT2A, psilocybiny, na naukę zależną od hipokampa. Myszy otrzymały pojedynczy zastrzyk psilocybiny (0,1, 0,5, 1,0 lub 1,5 mg/kg), 1,0 mg/kg ketanserinu (antagonisty 5-HT2A/C) lub soli fizjologicznej 24 godziny przed przyzwyczajeniem do otoczenia i późniejszym treningiem i badaniem w zadaniu śladowego warunkowania strachowego.

Materiały i metody

Obiekty badań

Samce myszy C57BL/6J (30-40 g) trzymano w standardowych klatkach laboratoryjnych i pozostawiono w spokoju przez 1 tydzień po przybyciu do zwierzętarni. Wszystkie myszy miały nieograniczony dostęp do wody i karmy laboratoryjnej i były trzymane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności w cyklu 12:12 światło/mrok, z początkiem światła o 7:00 rano. Spełnione zostały wszystkie wytyczne Narodowego Instytutu Zdrowia odnośnie Opieki i Stosowania Zwierząt Laboratoryjnych (National Institutes of Health, 2002).

Ogólna procedura

Myszy (n=9-10/warunek) otrzymały dootrzewnowo (i.p.) zastrzyk psilocybiny (0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg), ketanserinu (1,0 mg/kg) lub 0,9% roztworu soli fizjologicznej i 24 godziny później były przez 30 minut przyzwyczajane do komory testowej. Środowisko do warunkowania strachowego składało się z dwóch komór, każdej umieszczonej wewnątrz większej dźwiękoszczelnej komory. Zatrzymujący boks do monitorowania (freeze monitor box) (San Diego Instruments, San Diego, CA) o wymiarach 35,6 cm (szer.) x 38,1 cm (głęb.) x 31,8 cm (wys.) jest przeźroczystym pojemnikiem pleksiglasowym ze zdejmowaną pokrywą, z podłogą z metalowej siatki (0,3 cm drut kratki rozmieszczony od siebie co 0,8 cm) przez którą mógł być dostarczany wstrząs do stóp. Aktywność fotokomórek w komorze rejestrowała wertykalne i horyzontalne ruchy myszy. Dwie minuty po okresie przyzwyczajania, przez 3 minuty był rejestrowany odniesieniowy (BL - baseline) pomiar ruchu, służący jako bazowy pomiar przyzwyczajenia. Po każdej myszy boksy monitoringowe były czyszczone kwadrycydem by zażegnać ślady zapachowe. Po przyzwyczajeniu myszy powracały do swej klatki domowej.

Następnego dnia myszy powracały do tej samej komory do monitorowania i przechodziły trening by wykształcić skojarzenia CS-US (CS=conditioned stimulus, US=unconditioned stimulus - bodziec warunkowy-bodziec bezwarunkowy). Po 2 minutowym okresie aklimatyzacji, myszy były wystawiane na 10 prób śladowego warunkowania strachowego, co jest zilustrowane na Ryc. 3,1. Każda próba składała się z CS (dźwięku 82 dB, 15 s) a następnie interwału śladowego (30 s) i kończyła się przedłożeniem US (wstrząs 0,5 s, 1 mA) dostarczanego przez siatkową podłogę. Po zakończeniu każdej próby, następował 210 sekundowy przedział międzypróbowy (ITI - intertrial interval). Po każdej myszy boksy monitoringowe były czyszczone kwadrycydem by zażegnać ślady zapachowe, i myszy powracały po treningu do swej klatki domowej.

Ryc. 3,1 - Schematyczna reprezentacja Paradygmatu Śladowego Warunkowania Strachowego. Śladowe warunkowanie strachowe jest zadaniem zależnym od hipokampa, w którym prezentacja bodźca warunkowego (CS, dźwięk) jest oddzielona w czasie od bodźca bezwarunkowego (US, wstrząs) interwałem śladowym.

Na 3 dzień zadania, testowanie reakcji warunkowania strachowego zostało ocenione w 2 fazach. Pierwsza, myszy były na 5 min umieszczane w boksie monitoringowym, i przez ostatnie 3 minuty rejestrowany był ruch wykorzystany do ocenienia pomiaru strachu związanego z kontekstem treningu. Myszy następnie powracały do klatki domowej na 1 h. Druga, kontekst został zmieniony przez zamienienie podłogi kratkowej na podłogę z czarnego pleksiglasu i dodanie piłki bawełnianej z 1 ml zapachu waniliowego wewnątrz dźwiękoszczelnego pojemnika. Myszy były umieszczane wewnątrz nowego pojemnika, a po 2 minutach zapisywane były ruchy przez następne 3 minuty. Kolejne 10 prób prezentacji CS zostało wykonanych przy ITI wynoszącym 240s. Sygnał warunkowania strachowego oznaczono jako procent znieruchomienia podczas CS (dźwięk; 15s), podczas interwału śladowego (30s) oraz po śladzie, gdy wystąpiłby US. Uwarunkowany strach został określony jako wzrost procentu nieruchomości podczas testu sygnałowego. Procent nieruchomości został obliczony poprzez podzielenie czasu spędzonego nieruchomo podczas bodźca (CS, ślad, lub po śladzie) przez długość czasu trwania bodźca pomnożonego przez 100.

Projekt i analizy

Do ocenienia wpływu Dawki i Próby na każdą zmienną zależną w zadaniu śladowego warunkowania strachowego zastosowano odrębne dwuczynnikowe analizy powtarzanych pomiarów (ANOVA). Zarejestrowane pomiary zależne obejmowały procent znieruchomienia podczas CS, podczas śladu, po śladzie, podczas przyzwyczajania BL, podczas testu kontekstowego i w reakcji na nowe środowisko. W stosownych przypadkach, zastosowano analizy post hoc, takie jak Bonferroniego do wyizolowania skutków. Wszystkie analizy statystyczne zostaną określane jako istotne przy poziomie alfa 0,05.

Wyniki

Nabycie

Nabycie reakcji znieruchomienia jest przedstawione na Rycinie 3,2 ukazującej zarówno reakcję na CS (Rycina 3,2A) jak i w trakcie śladu (Rycina 3,2B). Stosując procentowy bezruch w reakcji na CS przez pierwsze 3 próby treningu, ANOVA ukazała, że bez względu na potraktowanie lekiem, zaszła istotna poprawa w całej próbie [F(2, 108) = 40,0, p<0,0001]. Zwłaszcza, wzrósł bezruch w reakcji na CS od próby 1 do próby 3, wskazując na wyuczony związek między bodźcami podczas treningu (p<0,05). ANOVA z procentu bezruchu podczas interwału śladowego ujawniła dodatkowo istotny wpływ próby [F(2, 108) = 20,0, p<0,0001]. Nastąpił uderzający wzrost w ilości czasu spędzonego w bezruchu podczas okresu śladu od próby 1 do próby 3 wykazując, że związek między CS i US sprzyjał bezruchowi w oczekiwaniu na wstrząs.

Ryc. 3,2 - Wpływ psilocybiny na nabycie śladowego uwarunkowania strachem. Myszy przeszły trening by wytworzyć skojarzenia CS-US poprzez wystawienie na 10 prób śladowego warunkowania strachowego. Każda próba składała się z prezentacji CS (dźwięk, 15s), po którym następował interwał śladowy (30s) i kończyła się US (wstrząs, 0,5s). A) Procent bezruchu podczas prezentacji 15s CS podczas pierwszych trzech prób parowania CS-US. B) Procent bezruchu podczas 30s interwału śladowego podczas pierwszych trzech prób parowania CS-US.
Kontekstowe warunkowanie strachowe

Kontekstowe warunkowanie strachowe oceniono poprzez porównanie procentowego bezruchu w zatrzymującym boksie do monitorowania w dniu przyzwyczajania, do procentowego bezruchu podczas testu kontekstowego. Nie było interakcji między Dawką a Próbą [F(5,90)=0,95; p=0,45] i nie było wpływu Dawki podczas przyzwyczajania BL lub testu kontekstowego [F(5,90)=1,15; p=0,34]. Jednakże wystąpił istotny wpływ Próby [F(1,90)=105,85; p<0,0001], wskazując, że myszy spędziły znacznie więcej czasu nieruchomiejąc po parach CS-US podczas testu kontekstowego, w porównaniu do przyzwyczajania bazowego. Rycina 3,3 ilustruje procent bezruchu podczas ekspozycji na zatrzymujący boks do monitorowania podczas przyzwyczajeniowego testu (A) oraz podczas testu kontekstowego warunkowania strachowego (B).

Ryc. 3,3 - Kontekstowe warunkowanie strachowe. Procent bezruchu wyrażony podczas wyeksponowania na zatrzymujący boks do monitorowania podczas przyzwyczajania (A) oraz podczas kontekstowego warunkowania strachowego (B). Wszystkie myszy ukazały kontekstowe uwarunkowanie strachowe jak wykazuje istotny wzrost procentu bezruchu podczas testu kontekstowego (p<0,05).
Sygnałowe warunkowanie strachowe

Reakcje zatrzymywania (% bezruchu) tylko podczas testu CS (dźwięk) zostały zilustrowane na Rycinie 3,4. Nastąpił istotny wpływ Próby [F(2,102)=7,83, p<0,0007] przy próbie 2 i 3 ujawniający znacznie większe znieruchomienie w reakcji na CS w porównaniu z próbą 1 (Rycina 3,4A). Nastąpił także istotny wpływ Dawki [F(5,51)=4,96, p<0.0009] ujawniający, że myszy kontrolne ukazały większą reakcję strachową na dźwięk w porównaniu do psilocybinowych 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg oraz ketanserinowych 1,0 mg/kg. ANOVA ujawniła istotny wpływ Dawki podczas interwału śladowego [F(5,51)=2,41, p<0,05]. Strach związany z interwałem śladowym podczas pierwszych trzech prób w dniu testowym został zredukowany u myszy potraktowanych 1,0 mg/kg psilocybiny w porównaniu do roztworu soli fizjologicznej oraz 1,5 mg/kg psilocybiny (Rycina 3,4B). Rycina 3,4C ilustruje reakcję strachową po interwale śladowym, która jest zbieżna z koordynacją dostarczenia US (wstrząs) podczas nabywania fazy parowania CS-US. Dwuczynnikowe powtórzone pomiary ANOVA ujawniły istotną interakcję między Dawką a Próbą [F(10,100)=3,53, p<0,0005]. Co ciekawe, myszy, którym podano niskie dawki psilocybiny (0,1 i 0,5 mg/kg) nieruchomiały bardziej w próbie 1 niż w próbie 2 i 3, sugerując, że są skłonniejsze do przystosowania się do nieobecności US, tak że reakcja strachowa zmniejszała się gdy US był wygaszony. Wzorzec ten był odwrotny u myszy potraktowanych ketanserinem, u których wzrosły reakcje strachowe od prób 1 do 3, wskazując na silną pamięć o US nawet przy jego nieobecności. Zebrane razem, dane te sugerują zróżnicowany wpływ psilocybiny na śladowe warunkowanie strachowe.

Ryc. 3,4 - Wpływ ostrej psilocybiny na sygnałowe warunkowanie strachowe. Sygnałowe warunkowanie strachowe zostało przebadane 24 godziny po okresie treningu, w którym myszy były wystawione na 10 prób parowania CS-US. A) Procent bezruchu podczas prezentacji 15s CS podczas pierwszych trzech prób tylko-CS. B) Procent bezruchu podczas 30s interwału śladowego podczas pierwszych trzech prób. C) Procent bezruchu gdy interwał śladowy, pokrywający się z momentem US (wstrząs) był dostarczany podczas nabywania fazy parowania CS-US.

Omówienie

Niniejsze badanie ilustruje udział receptora 5-HT2A w śladowym warunkowaniu strachowym, zadaniu nauki zależnym od hipokampa. Podczas nabywania reakcji bezruchu nastąpił uderzający wzrost ilości czasu spędzonego bez ruchu podczas prezentowania CS podczas okresu śladu od próby 1 do próby 3 (zobacz Rycina 3,2). Dane te wskazują, że związek między CS i US sprzyjał bezruchowi w oczekiwaniu na wstrząs, jednakże, nabywanie nauki nie zostało zmienione po ostrym podaniu psilocybiny lub ketanserinu.

Wszystkie warunki przejawiły podobne poziomy aktywności ruchowej w zatrzymującym boksie do monitorowania podczas przyzwyczajania bazowego oraz podczas ponownego wystawienia na to samo środowisko podczas testu kontekstowego warunkowania strachowego. Jak oczekiwano, myszy nieruchomiały znacznie bardziej podczas ponownego wystawienia na ten sam kontekst po uformowaniu związków CS-US w porównaniu do przyzwyczajenia bazowego, wskazując że wszystkie grupy wytworzyły reakcję warunkowania strachowego (Rycina 3,3). Dobrze wiadomo, że kontekstowe warunkowanie strachowe jest zadaniem zależnym od hipokampa (Kim & Fanselow, 1992; McNish et al., 1997; Hirsh, 1974; Esclassan et al., 2008; Frohardt et al., 1999). Z wydajnością zadania kontekstowego warunkowania strachowego powiązany został układ serotonergiczny (Dai et al., 2008). Niniejsze badanie stwierdziło, że receptor 5-HT2A nie zmienia kontekstowego warunkowania strachowego ponieważ nie zaobserwowano żadnych różnic między myszami kontrolnymi a potraktowanymi psilocybiną lub ketanserinem.

Niniejsze badanie sprawozdaje zmiany w warunkowaniu strachowym związanym z sygnałem pośredniczonym przez receptor 5-HT2A. Niezależnie od podanego leku wszystkie myszy wykształciły bezruch spowodowany sygnałem podczas prezentowania dźwięku w próbie wyłącznie z CS (zobacz Rycina 3,4). W czasie zbiegającym się z oczekiwaną prezentacją US (wstrząs), niskie dawki psilocybiny (0,1 i 0,5 mg/kg) wywoływały podwyższoną reakcję bezruchu w próbie 1 w porównaniu z innymi próbami, sugerując, że są bardziej skłonne dostosować się do nieobecności US, tak że reakcja strachowa zostaje zmniejszona gdy wygaszony zostaje US. Wzorzec ten był odwrotny u myszy potraktowanych ketanserinem, u których reakcje strachowe wzrosły od próby 1 do 3, wskazując na silną pamięć o US nawet przy jego nieobecności.

Synaptyczna plastyczność w HPC jest kluczowa przy zdobywaniu nauki oraz pamięci. Neurotropowy czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF - Brain Derived Neurotrophic Factor) powiązano z plastycznością synaptyczną i z przetwarzaniem pamięci (Kang et al. 1997; Pang et al. 2004; Tyler et al. 2002) poprzez modulację formowania synaps i wzrost grzbietu dendrytycznego w HPC (Bamji et al. 2006; Tyler i Pozzo-Miller 2001, 2003). Przewlekłe podawanie agonistów 5-HT (wliczając SSRI) reguluje w górę ekspresję BDNF mRNA w HPC (Nibuya et al. 1995, 1996).

Dowody sugerują, że receptor 5-HT2A jest zaangażowany w regulację BDNF w HPC (Vaidya et al. 1997). W szczególności, DOI, agonista receptora 5-HT2A/C, obniżył ekspresję BDNF mRNA w warstwie komórek ziarnistych w DG, lecz nie w podpolach CA w HPC. Co ciekawe, spadek ekspresji BDNF mRNA został zablokowany przez antagonistę receptora 5-HT2A, lecz nie przez antagonistę receptora 5-HT2C, angażując receptor 5-HT2A w regulację ekspresji BDNF (Vaidya et al. 1997).

Receptory 5-HT2A ulegają wysokiej ekspresji w całym HPC w zakręcie zębatym (DG), we wnęce (hilus), w rogu amona 1 (cornu ammonis - CA) oraz CA3 i są kolokalizowane na neuronach GABAergicznych, komórkach piramidowych i ziarnistych (Luttgen et al. 2004; Morilak et al. 1993, 1994; Pompeiano et al. 1994; Shen i Andrade 1998; Cornea-Hebert et al. 1999). Agoniści receptora 5-HT2A, stymulują kwas arachidonowy a w konsekwencji szlak fosfoinozytydowy skutkując aktywacją białkowej kinazy C (Kurrasch-Orbaugh et al., 2003; Ananth et al., 1987). Elektrofizjologiczne dowody sugerują, że receptory 5-HT2A stymulują interneurony GABAergiczne w HPC (Shen & Andrade, 1998). Aberracje w GABAergicznej funkcji w HPC powiązano z nauką i pamięcią ze względu na rolę hipokampowego GABA w integracji czasowo-przestrzennej (Wallenstein et al., 1998).

Zebrane ze sobą, dane sprawozdane w niniejszym badaniu wiążą receptor 5-HT2A z nauką zależną od hipokampa. Niniejsze badanie informuje, że wcześniejsze wystawienie na działanie psilocybiny zmieniło reagowanie w nowym środowisku, znamionujące nieobecność reakcji strachu, efekt nie wykryty u myszy kontrolnych. Ponadto, niskie dawki psilocybiny podwyższyły wywołane sygnałem warunkowanie strachowe a antagoniści receptora 5-HT2A/C zmniejszyli warunkowanie strachowe na sygnał. Wyniki tego badania zwiększają możliwość tego, że aktywność receptora 5-HT2A może prowadzić do zmian w nauce i pamięci zależnych od hipokampa.

Podziękowania

Praca ta została wsparta przez Helen Ellis Research Endowment (JSR). Dziękujemy dr Francisco Moreno z Uniwersytetu Arizony oraz dr Rickowi Doblinowi z Multidyscyplinarnego Stowarzyszenia do Badań Psychedelicznych (MAPS - Multidisciplinary Association for Psychedelic Studies) za sprezentowanie psilocybiny.

O autorce

Briony Catlow urodziła się 7 listopada 1978 w Auckland, w Nowej Zealandii. Przeniosła się do Stanów Zjednoczonych w 1995 by ukończyć rok studiów w szkole wyższej. Podczas tego roku zaczęła wolontariuszować dla Coastal Expeditions, firmy organizującej wycieczki kajakowe w Charleston, SC i zakochała się w Carolina Lowcountry. Ukończyła Wando High School w Mt Pleasant, SC, a następnie wstąpiła do College w Charleston w SC gdzie specjalizowała się w biologii. Po ukończeniu studiów, przeniosła się do Tampa, FL by doktoryzować się na Uniwersytecie Południowej Florydy.

Bibliografia

  1. Aimone, J. B., Wiles, J., & Gage, F. H. (2006). Potential role for adult neurogenesis in the encoding of time in new memories. Nat.Neurosci., 9,723-727.
  2. Altman, J. (1962). Are new neurons formed in the brains of adult mammals? Science, 135, 1127-1128.
  3. Altman, J (1969). Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis. IV. Cell proliferation and migration in the anterior forebrain, with special reference to persisting neurogenesis in the olfactory bulb. J.Comp Neurol., 137, 433-457.
  4. Altman, J. (1963). Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. Anat.Rec., 145, 573-591.
  5. Altman, J. & Das, G. D. (1965). Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J.Comp Neurol., 124, 319-335.
  6. Ambrogini, P., Lattanzi, D., Ciuffoli, S., Agostini, D., Bertini, L., Stocchi, V. et al. (2004). Morpho-functional characterization of neuronal cells at different stages of maturation in granule cell layer of adult rat dentate gyrus. Brain Res., 1017, 21-31.
  7. Ananth, U. S., Leli, U., & Hauser, G. (1987). Stimulation of phosphoinositide hydrolysis by serotonin in C6 glioma cells. J.Neurochem., 48, 253-261.
  8. Azmitia, E. C. & Segal, M. (1978). An autoradiographic analysis of the differential ascending projections of the dorsal and median raphe nuclei in the rat. J.Comp Neurol., 179, 641-667.
  9. Bamji, S. X., Rico, B., Kimes, N., & Reichardt, L. F. (2006). BDNF mobilizes synaptic vesicles and enhances synapse formation by disrupting cadherin-beta-catenin interactions. J.Cell Biol., 174, 289-299.
  10. Banasr, M., Hery, M., Printemps, R., & Daszuta, A. (2004). Serotonin-induced increases in adult cell proliferation and neurogenesis are mediated through different and common 5-HT receptor subtypes in the dentate gyrus and the subventricular zone. Neuropsychopharmacology, 29, 450-460.
  11. Barnes, N. M. & Sharp, T. (1999). A review of central 5-HT receptors and their function. Neuropharmacology, 38, 1083-1152.
  12. Bernier, P. J., Bedard, A., Vinet, J., Levesque, M., & Parent, A. (2002). Newly generated neurons in the amygdala and adjoining cortex of adult primates. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 99, 11464-11469.
  13. Bizon, J. L. & Gallagher, M. (2003). Production of new cells in the rat dentate gyrus over the lifespan: relation to cognitive decline. Eur.J.Neurosci., 18,215-219.
  14. Bjarkam, C. R., Sorensen, J. C., & Geneser, F. A. (2003). Distribution and morphology of serotonin-immunoreactive axons in the hippocampal region of the New Zealand white rabbit. I. Area dentata and hippocampus. Hippocampus, 13, 21-37
  15. Braden, M. R., Parrish, J. C., Naylor, J. C., & Nichols, D. E. (2006). Molecular interaction of serotonin 5-HT2A receptor residues Phe339(6.51) and Phe340(6.52) with superpotent N-benzyl phenethylamine agonists. Mol.Pharmacol., 70, 1956-1964.
  16. Brandt, M. D., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G., Reuter, K., Bick-Sander, A. et al. (2003). Transient calretinin expression defines early postmitotic step of neuronal differentiation in adult hippocampal neurogenesis of mice. Mol.Cell Neurosci., 24, 603-613.
  17. Brezun, J. M. & Daszuta, A. (1999). Depletion in serotonin decreases neurogenesis in the dentate gyrus and the subventricular zone of adult rats. Neuroscience, 89, 999-1002.
  18. Brezun, J. M. & Daszuta, A. (2000). Serotonin may stimulate granule cell proliferation in the adult hippocampus, as observed in rats grafted with foetal raphe neurons. Eur.J.Neurosci., 12, 391-396.
  19. Brown, J., Cooper-Kuhn, C. M., Kempermann, G., Van, P. H., Winkler, J., Gage, F. H. et al. (2003). Enriched environment and physical activity stimulate hippocampal but not olfactory bulb neurogenesis. Eur.J.Neurosci., 17,2042-2046.
  20. Buckholtz, N. S., Freedman, D. X., & Middaugh, L. D. (1985). Daily LSD administration selectively decreases serotonin2 receptor binding in rat brain. Eur.J.Pharmacol., 109, 421-425.
  21. Buckholtz, N. S., Zhou, D. F., & Freedman, D. X. (1988). Serotonin2 agonist administration down-regulates rat brain serotonin2 receptors. Life Sci., 42,2439-2445.
  22. Buckholtz, N. S., Zhou, D. F., Freedman, D. X., & Potter, W. Z. (1990). Lysergic acid diethylamide (LSD) administration selectively downregulates serotonin2 receptors in rat brain. Neuropsychopharmacology, 3, 137-148.
  23. Cahill, L. & McGaugh, J. L. (1998). Mechanisms of emotional arousal and lasting declarative memory. Trends Neurosci., 21, 294-299.
  24. Cameron, H. A. & McKay, R. D. (1999). Restoring production of hippocampal neurons in old age. Nat.Neurosci., 2, 894-897.
  25. Cameron, H. A., Woolley, C. S., & Gould, E. (1993). Adrenal steroid receptor immunoreactivity in cells born in the adult rat dentate gyrus. Brain Res., 611, 342-346.
  26. Carro, E., Nunez, A., Busiguina, S., & Torres-Aleman, I. (2000). Circulating insulin-like growth factor I mediates effects of exercise on the brain. J.Neurosci., 20, 2926-2933.
  27. Carro, E., Trejo, J. L., Busiguina, S., & Torres-Aleman, I. (2001). Circulating insulin-like growth factor I mediates the protective effects of physical exercise against brain insults of different etiology and anatomy. J.Neurosci., 21, 5678-5684.
  28. Cerletti, A. (1959). [Teonanacatl and psilocybin.]. Dtsch.Med.Wochenschr., 84,2317-2321.
  29. Cerletti, A. & Konzett, H. (1956). [Specific inhibition of serotonin effects by lysergic acid diethylamide and similar compounds.]. Naunyn Schmiedebergs Arch.Exp.Pathol.Pharmakol., 228, 146-148.
  30. Cheng, A., Wang, S., Cai, J., Rao, M. S., & Mattson, M. P. (2003). Nitric oxide acts in a positive feedback loop with BDNF to regulate neural progenitor cell proliferation and differentiation in the mammalian brain. Dev.Biol., 258,319-333.
  31. Clemett, D. A., Punhani, T., Duxon, M. S., Blackburn, T. P., & Fone, K. C. (2000). Immunohistochemical localisation of the 5-HT2C receptor protein in the rat CNS. Neuropharmacology, 39, 123-132.
  32. Cornea-Hebert, V., Riad, M., Wu, C., Singh, S. K., & Descarries, L. (1999). Cellular and subcellular distribution of the serotonin 5-HT2A receptor in the central nervous system of adult rat. J.Comp Neurol., 409, 187-209.
  33. Corotto, F. S., Henegar, J. A., & Maruniak, J. A. (1993). Neurogenesis persists in the subependymal layer of the adult mouse brain. Neurosci.Lett., 149,111-114.
  34. D'Sa, C. & Duman, R. S. (2002). Antidepressants and neuroplasticity. Bipolar.Disord., 4, 183-194.
  35. Dai, J. X., Han, H. L., Tian, M., Cao, J., Xiu, J. B., Song, N. N. et al. (2008). Enhanced contextual fear memory in central serotonin-deficient mice. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 105, 11981-11986.
  36. Djavadian, R. L., Wielkopolska, E., Bialoskorska, K., & Turlejski, K. (1999). Localization of the 5-HT1A receptors in the brain of opossum Monodelphis domestica. Neuroreport, 10, 3195-3200.
  37. Ehninger, D. & Kempermann, G. (2003). Regional effects of wheel running and environmental enrichment on cell genesis and microglia proliferation in the adult murine neocortex. Cereb.Cortex, 13, 845-851.
  38. El, M. S., Taussig, D., Gozlan, H., Emerit, M. B., Ponchant, M., & Hamon, M. (1989). Chromatographic analyses of the serotonin 5-HT1A receptor solubilized from the rat hippocampus. J.Neurochem., 53, 1555-1566.
  39. Eriksson, P. S., Perfilieva, E., Bjork-Eriksson, T., Alborn, A. M., Nordborg, C., Peterson, D. A. et al. (1998). Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat.Med., 4, 1313-1317.
  40. Esclassan, F., Coutureau, E., Di, S. G., & Marchand, A. R. (2008). Differential contribution of dorsal and ventral hippocampus to trace and delay fear conditioning. Hippocampus.
  41. Fabel, K., Fabel, K., Tam, B., Kaufer, D., Baiker, A., Simmons, N. et al. (2003). VEGF is necessary for exercise-induced adult hippocampal neurogenesis. Eur.J.Neurosci., 18, 2803-2812.
  42. Farmer, J., Zhao, X., Van, P. H., Wodtke, K., Gage, F. H., & Christie, B. R. (2004). Effects of voluntary exercise on synaptic plasticity and gene expression in the dentate gyrus of adult male Sprague-Dawley rats in vivo. Neuroscience, 124, 71-79.
  43. Feldberg, W. & Myers, R. D. (1964). Effects on temperature of amines injected into the cerebral ventricles. A new concept of temperature regulation. J.Physiol, 173, 226-231.
  44. Filippov, V., Kronenberg, G., Pivneva, T., Reuter, K., Steiner, B., Wang, L. P. et al. (2003). Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes. Mol.Cell Neurosci., 23, 373-382.
  45. Flood, J. F. & Cherkin, A. (1987). Fluoxetine enhances memory processing in mice. Psychopharmacology (Berl), 93, 36-43.
  46. Frohardt, R. J., Guarraci, F. A., & Young, S. L. (1999). Intrahippocampal infusions of a metabotropic glutamate receptor antagonist block the memory of context-specific but not tone-specific conditioned fear. Behav.Neurosci., 113, 222-227.
  47. Fuchs, E. & Weber, K. (1994). Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease. Annu.Rev.Biochem., 63, 345-382.
  48. Fukuda, S., Kato, F., Tozuka, Y., Yamaguchi, M., Miyamoto, Y., & Hisatsune, T. (2003). Two distinct subpopulations of nestin-positive cells in adult mouse dentate gyrus. J.Neurosci., 23, 9357-9366.
  49. Gould, E., Beylin, A., Tanapat, P., Reeves, A., & Shors, T. J. (1999a). Learning enhances adult neurogenesis in the hippocampal formation. Nat.Neurosci., 2, 260-265.
  50. Gould, E., Cameron, H. A., Daniels, D. C., Woolley, C. S., & McEwen, B. S. (1992). Adrenal hormones suppress cell division in the adult rat dentate gyrus. J.Neurosci., 12, 3642-3650.
  51. Gould, E., McEwen, B. S., Tanapat, P., Galea, L. A., & Fuchs, E. (1997). Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. J.Neurosci., 17, 2492-2498.
  52. Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., & Gross, C. G. (1999b). Neurogenesis in the neocortex of adult primates. Science, 286, 548-552.
  53. Gould, E., Tanapat, P., Hastings, N. B., & Shors, T. J. (1999c). Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends Cogn Sci., 3, 186-192.
  54. Halasy, K. & Somogyi, P. (1993). Subdivisions in the multiple GABAergic innervation of granule cells in the dentate gyrus of the rat hippocampus. Eur.J.Neurosci., 5, 411-429.
  55. Hirsh, R. (1974). The hippocampus and contextual retrieval of information from memory: a theory. Behav.Biol., 12, 421-444.
  56. Hofmann, A., FREY, A., OTT, H., PETR, Z. T., & TROXLER, F. (1958a). [Elucidation of the structure and the synthesis of psilocybin.]. Experientia, 14, 397-399.
  57. Hofmann, A., HEIM, R., BRACK, A., & KOBEL, H. (1958b). [Psilocybin, a psychotropic substance from the Mexican mushroom Psilocybe mexicana Heim.]. Experientia, 14, 107-109.
  58. Huang, L., DeVries, G. J., & Bittman, E. L. (1998). Photoperiod regulates neuronal bromodeoxyuridine labeling in the brain of a seasonally breeding mammal. J.Neurobiol., 36, 410-420.
  59. Huang, S. C., Tsai, S. J., & Chang, J. C. (2004). Fluoxetine-induced memory impairment in four family members. Int.J.Psychiatry Med., 34, 197-200.
  60. Jacobs, B. L. & Azmitia, E. C. (1992). Structure and function of the brain serotonin system. Physiol Rev., 72, 165-229.
  61. Jacobs, B. L., Praag, H., & Gage, F. H. (2000). Adult brain neurogenesis and psychiatry: a novel theory of depression. Mol.Psychiatry, 5, 262-269.
  62. Jha, S., Rajendran, R., Fernandes, K. A., & Vaidya, V. A. (2008). 5-HT2A/2C receptor blockade regulates progenitor cell proliferation in the adult rat hippocampus. Neurosci.Lett., 441, 210-214.
  63. Jouvet, M. (1967). Neurophysiology of the states of sleep. Physiol Rev., 47, 117-177.
  64. Kang, H., Welcher, A. A., Shelton, D., & Schuman, E. M. (1997). Neurotrophins and time: different roles for TrkB signaling in hippocampal long-term potentiation. Neuron, 19, 653-664.
  65. Kaplan, M. S. & Hinds, J. W. (1977). Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science, 197, 1092-1094.
  66. Kempermann, G., Kuhn, H. G., & Gage, F. H. (1997). More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature, 386, 493-495.
  67. Kempermann, G., Kuhn, H. G., & Gage, F. H. (1998). Experience-induced neurogenesis in the senescent dentate gyrus. J.Neurosci., 18, 3206-3212.
  68. Kim, J. J. & Fanselow, M. S. (1992). Modality-specific retrograde amnesia of fear. Science, 256, 675-677.
  69. King, A. R., Martin, I. L., & Melville, K. A. (1974). Reversal learning enhanced by lysergic acid diethylamide (LSD): concomitant rise in brain 5-hydroxytryptamine levels. Br.J.Pharmacol., 52, 419-426.
  70. King, A. R., Martin, I. L., & Seymour, K. A. (1972). Reversal learning facilitated by a single injection of lysergic acid diethylamide (LSD 25) in the rat. Br.J.Pharmacol., 45, 161P-162P.
  71. Kinsey, A. M., Wainwright, A., Heavens, R., Sirinathsinghji, D. J., & Oliver, K. R. (2001). Distribution of 5-ht(5A), 5-ht(5B), 5-ht(6) and 5-HT(7) receptor mRNAs in the rat brain. Brain Res.Mol.Brain Res., 88, 194-198.
  72. Koenig, J., Cosquer, B., & Cassel, J. C. (2008). Activation of septal 5-HT1A receptors alters spatial memory encoding, interferes with consolidation, but does not affect retrieval in rats subjected to a water-maze task. Hippocampus, 18, 99-118.
  73. Kronenberg, G., Reuter, K., Steiner, B., Brandt, M. D., Jessberger, S., Yamaguchi, M. et al. (2003). Subpopulations of proliferating cells of the adult hippocampus respond differently to physiologic neurogenic stimuli. J.Comp Neurol., 467, 455-463.
  74. Kuhn, H. G., ckinson-Anson, H., & Gage, F. H. (1996). Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J.Neurosci., 16, 2027-2033.
  75. Kurrasch-Orbaugh, D. M., Parrish, J. C., Watts, V. J., & Nichols, D. E. (2003). A complex signaling cascade links the serotonin2A receptor to phospholipase A2 activation: the involvement of MAP kinases. J.Neurochem., 86, 980-991.
  76. Lee, J., Duan, W., Long, J. M., Ingram, D. K., & Mattson, M. P. (2000). Dietary restriction increases the number of newly generated neural cells, and induces BDNF expression, in the dentate gyrus of rats. J.Mol.Neurosci., 15, 99-108.
  77. Lee, J., Duan, W., & Mattson, M. P. (2002). Evidence that brain-derived neurotrophic factor is required for basal neurogenesis and mediates, in part, the enhancement of neurogenesis by dietary restriction in the hippocampus of adult mice. J.Neurochem., 82, 1367-1375.
  78. Leger, L., Charnay, Y., Hof, P. R., Bouras, C., & Cespuglio, R. (2001). Anatomical distribution of serotonin-containing neurons and axons in the central nervous system of the cat. J.Comp Neurol., 433, 157-182.
  79. Leibowitz, S. F. & Shor-Posner, G. (1986). Brain serotonin and eating behavior. Appetite, 7 Suppl, 1-14.
  80. Lemaire, V., Koehl, M., Le, M. M., & Abrous, D. N. (2000). Prenatal stress produces learning deficits associated with an inhibition of neurogenesis in the hippocampus. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 97, 11032-11037.
  81. Lichtenwalner, R. J., Forbes, M. E., Bennett, S. A., Lynch, C. D., Sonntag, W. E., & Riddle, D. R. (2001). Intracerebroventricular infusion of insulin-like growth factor-I ameliorates the age-related decline in hippocampal neurogenesis. Neuroscience, 107, 603-613.
  82. Lu, L., Bao, G., Chen, H., Xia, P., Fan, X., Zhang, J. et al. (2003). Modification of hippocampal neurogenesis and neuroplasticity by social environments. Exp.Neurol., 183, 600-609.
  83. Lucki, I. (1992). 5-HT1 receptors and behavior. Neurosci.Biobehav.Rev., 16, 83-93.
  84. Luttgen, M., Ove, O. S., & Meister, B. (2004). Chemical identity of 5-HT2A receptor immunoreactive neurons of the rat septal complex and dorsal hippocampus. Brain Res., 1010, 156-165.
  85. Malberg, J. E. & Duman, R. S. (2003). Cell proliferation in adult hippocampus is decreased by inescapable stress: reversal by fluoxetine treatment. Neuropsychopharmacology, 28, 1562-1571.
  86. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., & Duman, R. S. (2000). Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J.Neurosci., 20, 9104-9110.
  87. McEchron, M. D., Bouwmeester, H., Tseng, W., Weiss, C., & Disterhoft, J. F. (1998). Hippocampectomy disrupts auditory trace fear conditioning and contextual fear conditioning in the rat. Hippocampus, 8, 638-646.
  88. McKenna, D. J., Repke, D. B., Lo, L., & Peroutka, S. J. (1990). Differential interactions of indolealkylamines with 5-hydroxytryptamine receptor subtypes. Neuropharmacology, 29, 193-198.
  89. McNish, K. A., Gewirtz, J. C., & Davis, M. (1997). Evidence of contextual fear after lesions of the hippocampus: a disruption of freezing but not fear-potentiated startle. J.Neurosci., 17, 9353-9360.
  90. Messier, B. & Leblond, C. P. (1960). Cell proliferation and migration as revealed by radioautography after injection of thymidine-H3 into male rats and mice. Am.J.Anat., 106, 247-285.
  91. Messier, B., Leblond, C. P., & Smart, I. (1958). Presence of DNA synthesis and mitosis in the brain of young adult mice. Exp.Cell Res., 14, 224-226.
  92. Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., & Gleeson, J. G. (2002). Selective expression of doublecortin and LIS1 in developing human cortex suggests unique modes of neuronal movement. Cereb.Cortex, 12, 1225-1236.
  93. Monnier, M. (1959). [The action of psilocybin on the rabbit brain.]. Experientia, 15, 321-323.
  94. Moore, R. Y. & Halaris, A. E. (1975). Hippocampal innervation by serotonin neurons of the midbrain raphe in the rat. J.Comp Neurol., 164, 171-183.
  95. Morilak, D. A., Garlow, S. J., & Ciaranello, R. D. (1993). Immunocytochemical localization and description of neurons expressing serotonin2 receptors in the rat brain. Neuroscience, 54, 701-717.
  96. Morilak, D. A., Somogyi, P., Lujan-Miras, R., & Ciaranello, R. D. (1994). Neurons expressing 5-HT2 receptors in the rat brain: neurochemical identification of cell types by immunocytochemistry. Neuropsychopharmacology, 11,157-166.
  97. Mullen, R. J., Buck, C. R., & Smith, A. M. (1992). NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development, 116, 201-211.
  98. Nibuya, M., Morinobu, S., & Duman, R. S. (1995). Regulation of BDNF and trkB mRNA in rat brain by chronic electroconvulsive seizure and antidepressant drug treatments. J.Neurosci., 15, 7539-7547.
  99. Nibuya, M., Nestler, E. J., & Duman, R. S. (1996). Chronic antidepressant administration increases the expression of cAMP response element binding protein (CREB) in rat hippocampus. J.Neurosci., 16, 2365-2372.
  100. Nichols, D. E. (2004). Hallucinogens. Pharmacol.Ther., 101, 131-181.
  101. Nilsson, M., Perfilieva, E., Johansson, U., Orwar, O., & Eriksson, P. S. (1999). Enriched environment increases neurogenesis in the adult rat dentate gyrus and improves spatial memory. J.Neurobiol., 39, 569-578.
  102. Oh, M. S., Park, C., Huh, Y., Kim, H. Y., Kim, H., Kim, H. M. et al. (2006). The effects of BR003 on memory and cell proliferation in the dentate gyrus of rat hippocampus. Biol.Pharm.Bull., 29, 813-816.
  103. Pang, P. T., Teng, H. K., Zaitsev, E., Woo, N. T., Sakata, K., Zhen, S. et al. (2004). Cleavage of proBDNF by tPA/plasmin is essential for long-term hippocampal plasticity. Science, 306, 487-491.
  104. Parent, A., Descarries, L., & Beaudet, A. (1981). Organization of ascending serotonin systems in the adult rat brain. A radioautographic study after intraventricular administration of [3H]5-hydroxytryptamine. Neuroscience, 6, 115-138.
  105. Passie, T., Seifert, J., Schneider, U., & Emrich, H. M. (2002). The pharmacology of psilocybin. Addict.Biol., 7, 357-364.
  106. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., & Luskin, M. B. (2001). Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and hypothalamus. J.Neurosci., 21, 6706-6717.
  107. Pham, K., Nacher, J., Hof, P. R., & McEwen, B. S. (2003). Repeated restraint stress suppresses neurogenesis and induces biphasic PSA-NCAM expression in the adult rat dentate gyrus. Eur.J.Neurosci., 17, 879-886.
  108. Pinder, R. M. & Wieringa, J. H. (1993). Third-generation antidepressants. Med.Res.Rev., 13, 259-325.
  109. Pompeiano, M., Palacios, J. M., & Mengod, G. (1994). Distribution of the serotonin 5-HT2 receptor family mRNAs: comparison between 5-HT2A and 5-HT2C receptors. Brain Res.Mol.Brain Res., 23, 163-178.
  110. Radley, J. J. & Jacobs, B. L. (2002). 5-HT1A receptor antagonist administration decreases cell proliferation in the dentate gyrus. Brain Res., 955, 264-267.
  111. Ramirez, O. A. & Carrer, H. F. (1989). Correlation between threshold to induce long-term potentiation in the hippocampus and performance in a shuttle box avoidance response in rats. Neurosci.Lett., 104, 152-156.
  112. Ramon, Y. C. (1952). Structure and connections of neurons. Bull.Los.Angel.Neuro.Soc., 17, 5-46.
  113. Raymond, J. R., Mukhin, Y. V., Gelasco, A., Turner, J., Collinsworth, G., Gettys, T. W. et al. (2001). Multiplicity of mechanisms of serotonin receptor signal transduction. Pharmacol.Ther., 92, 179-212.
  114. Ribak, C. E., Seress, L., & Amaral, D. G. (1985). The development, ultrastructure and synaptic connections of the mossy cells of the dentate gyrus. J.Neurocytol., 14, 835-857.
  115. Saha, S. & Datta, S. (2005). Two-way active avoidance training-specific increases in phosphorylated cAMP response element-binding protein in the dorsal hippocampus, amygdala, and hypothalamus. Eur.J.Neurosci., 21, 3403-3414.
  116. Sahgal, A. & Mason, J. (1985). Drug effects on memory: assessment of a combined active and passive avoidance task. Behav.Brain Res., 17, 251-255.
  117. Santarelli, L., Saxe, M., Gross, C., Surget, A., Battaglia, F., Dulawa, S. et al. (2003). Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science, 301, 805-809.
  118. Sarnyai, Z., Sibille, E. L., Pavlides, C., Fenster, R. J., McEwen, B. S., & Toth, M. (2000). Impaired hippocampal-dependent learning and functional abnormalities in the hippocampus in mice lacking serotonin(1A) receptors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 97, 14731-14736.
  119. Scholzen, T. & Gerdes, J. (2000). The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J.Cell Physiol, 182, 311-322.
  120. Seki, T. & Arai, Y. (1995). Age-related production of new granule cells in the adult dentate gyrus. Neuroreport, 6, 2479-2482.
  121. Seri, B., Garcia-Verdugo, J. M., Collado-Morente, L., McEwen, B. S., & varez-Buylla, A. (2004). Cell types, lineage, and architecture of the germinal zone in the adult dentate gyrus. J.Comp Neurol., 478, 359-378.
  122. Seri, B., Garcia-Verdugo, J. M., McEwen, B. S., & varez-Buylla, A. (2001). Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. J.Neurosci., 21, 7153-7160.
  123. Sheard, M. H. (1969). The effect of p-chlorophenylalanine on behavior in rats: relation to brain serotonin and 5-hydroxyindoleacetic acid. Brain Res., 15,524-528.
  124. Shen, R. Y. & Andrade, R. (1998). 5-Hydroxytryptamine2 receptor facilitates GABAergic neurotransmission in rat hippocampus. J.Pharmacol.Exp.Ther., 285, 805-812.
  125. Shirayama, Y., Chen, A. C., Nakagawa, S., Russell, D. S., & Duman, R. S. (2002). Brain-derived neurotrophic factor produces antidepressant effects in behavioral models of depression. J.Neurosci., 22, 3251-3261.
  126. Shors, T. J., Miesegaes, G., Beylin, A., Zhao, M., Rydel, T., & Gould, E. (2001). Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories. Nature, 410, 372-376.
  127. Shors, T. J., Townsend, D. A., Zhao, M., Kozorovitskiy, Y., & Gould, E. (2002). Neurogenesis may relate to some but not all types of hippocampal-dependent learning. Hippocampus, 12, 578-584.
  128. Sidman, R. L., Miale, I. L., & Feder, N. (1959). Cell proliferation and migration in the primitive ependymal zone: an autoradiographic study of histogenesis in the nervous system. Exp.Neurol., 1, 322-333.
  129. Squire, L. R. (1992). Memory and the hippocampus: a synthesis from findings with rats, monkeys, and humans. Psychol.Rev., 99, 195-231.
  130. Squire, L. R., Ojemann, J. G., Miezin, F. M., Petersen, S. E., Videen, T. O., & Raichle, M. E. (1992). Activation of the hippocampus in normal humans: a functional anatomical study of memory. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 89,1837-1841.
  131. Tanapat, P., Hastings, N. B., Rydel, T. A., Galea, L. A., & Gould, E. (2001). Exposure to fox odor inhibits cell proliferation in the hippocampus of adult rats via an adrenal hormone-dependent mechanism. J.Comp Neurol., 437,496-504.
  132. Tecott, L. H., Maricq, A. V., & Julius, D. (1993). Nervous system distribution of the serotonin 5-HT3 receptor mRNA. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 90, 1430-1434.
  133. Thomas, E. A., Matli, J. R., Hu, J. L., Carson, M. J., & Sutcliffe, J. G. (2000). Pertussis toxin treatment prevents 5-HT(5a) receptor-mediated inhibition of cyclic AMP accumulation in rat C6 glioma cells. J.Neurosci.Res., 61,75-81.
  134. Trejo, J. L., Carro, E., & Torres-Aleman, I. (2001). Circulating insulin-like growth factor I mediates exercise-induced increases in the number of new neurons in the adult hippocampus. J.Neurosci., 21, 1628-1634.
  135. Tyler, W. J., Alonso, M., Bramham, C. R., & Pozzo-Miller, L. D. (2002). From acquisition to consolidation: on the role of brain-derived neurotrophic factor signaling in hippocampal-dependent learning. Learn.Mem., 9, 224-237.
  136. Tyler, W. J. & Pozzo-Miller, L. (2003). Miniature synaptic transmission and BDNF modulate dendritic spine growth and form in rat CA1 neurones. J.Physiol, 553, 497-509.
  137. Tyler, W. J. & Pozzo-Miller, L. D. (2001). BDNF enhances quantal neurotransmitter release and increases the number of docked vesicles at the active zones of hippocampal excitatory synapses. J.Neurosci., 21,4249-4258.
  138. Uittenbogaard, M. & Chiaramello, A. (2002). Constitutive overexpression of the basic helix-loop-helix Nex1/MATH-2 transcription factor promotes neuronal differentiation of PC12 cells and neurite regeneration. J.Neurosci.Res., 67, 235-245.
  139. Ulloor, J. & Datta, S. (2005). Spatio-temporal activation of cyclic AMP response element-binding protein, activity-regulated cytoskeletal-associated protein and brain-derived nerve growth factor: a mechanism for pontine-wave generator activation-dependent two-way active-avoidance memory processing in the rat. J.Neurochem., 95, 418-428.
  140. Vaidya, V. A., Marek, G. J., Aghajanian, G. K., & Duman, R. S. (1997). 5-HT2A receptor-mediated regulation of brain-derived neurotrophic factor mRNA in the hippocampus and the neocortex. J.Neurosci., 17, 2785-2795.
  141. Van der Zee, E. A. & Luiten, P. G. (1999). Muscarinic acetylcholine receptors in the hippocampus, neocortex and amygdala: a review of immunocytochemical localization in relation to learning and memory. Prog.Neurobiol., 58, 409-471.
  142. Van der, B. K., Meerlo, P., Luiten, P. G., Eggen, B. J., & Van der Zee, E. A. (2005). Effects of active shock avoidance learning on hippocampal neurogenesis and plasma levels of corticosterone. Behav.Brain Res., 157,23-30.
  143. Van, P. H., Christie, B. R., Sejnowski, T. J., & Gage, F. H. (1999a). Running enhances neurogenesis, learning, and long-term potentiation in mice. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 96, 13427-13431.
  144. Van, P. H., Kempermann, G., & Gage, F. H. (1999b). Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nat.Neurosci., 2, 266-270.
  145. Van, P. H., Schinder, A. F., Christie, B. R., Toni, N., Palmer, T. D., & Gage, F. H. (2002). Functional neurogenesis in the adult hippocampus. Nature, 415,1030-1034.
  146. Van, R. J., Dikova, M., Werbrouck, L., Clincke, G., & Borgers, M. (1992). Synaptic plasticity in rat hippocampus associated with learning. Behav.Brain Res., 51, 179-183.
  147. Varrault, A., Bockaert, J., & Waeber, C. (1992). Activation of 5-HT1A receptors expressed in NIH-3T3 cells induces focus formation and potentiates EGF effect on DNA synthesis. Mol.Biol.Cell, 3, 961-969.
  148. Vertes, R. P., Fortin, W. J., & Crane, A. M. (1999). Projections of the median raphe nucleus in the rat. J.Comp Neurol., 407, 555-582.
  149. Vilaro, M. T., Cortes, R., Gerald, C., Branchek, T. A., Palacios, J. M., & Mengod, G. (1996). Localization of 5-HT4 receptor mRNA in rat brain by in situ hybridization histochemistry. Brain Res.Mol.Brain Res., 43, 356-360.
  150. Vollenweider, F. X., Vollenweider-Scherpenhuyzen, M. F., Babler, A., Vogel, H., & Hell, D. (1998). Psilocybin induces schizophrenia-like psychosis in humans via a serotonin-2 agonist action. Neuroreport, 9, 3897-3902.
  151. Wallenstein, G. V., Eichenbaum, H., & Hasselmo, M. E. (1998). The hippocampus as an associator of discontiguous events. Trends Neurosci., 21, 317-323.
  152. Wang, L. P., Kempermann, G., & Kettenmann, H. (2005). A subpopulation of precursor cells in the mouse dentate gyrus receives synaptic GABAergic input. Mol.Cell Neurosci., 29, 181-189.
  153. Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., & Disterhoft, J. F. (1999). Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav.Brain Res., 99, 123-132.
  154. Winter, J. C., Rice, K. C., Amorosi, D. J., & Rabin, R. A. (2007). Psilocybin-induced stimulus control in the rat. Pharmacol.Biochem.Behav., 87, 472-480.
  155. Witter, M. P. (1993). Organization of the entorhinal-hippocampal system: a review of current anatomical data. Hippocampus, 3 Spec No, 33-44.
  156. Zhao, C., Teng, E. M., Summers, R. G., Jr., Ming, G. L., & Gage, F. H. (2006). Distinct morphological stages of dentate granule neuron maturation in the adult mouse hippocampus. J.Neurosci., 26, 3-11.
[ tłumaczenie: cjuchu ]



szukaj na psilosophy:  
 
Odsłon
od 31.08.2016



komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze

. .twój komentarz :

nick / ksywa :



komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze komentarze



PoradnikI ]   [ GatunkI ]   [ Honorowi psilodawcY ]   [ PsilosOpediuM ]   [ FaQ ]   [ ForuM ]   [ GalerY ]   [ TripograM ]   [ DarwiN ]   [ LinkI ]   [ EmaiL ]  

© psilosophy 2001-2017